基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用技术

本发明专利技术公开了一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用，属于电致化学发光领域；它先将壳聚糖滴涂于电极表面，通过共价作用先后将石墨烯量子点和多肽组装到电极表面；在蛋白激酶和三磷酸腺苷的作用下，多肽发生磷酸化，通过抗原-抗体之间的特异性识别作用，磷酸化抗体共轭的氧化石墨烯被组装到多肽的磷酸化丝氨酸位点上，拉近了氧化石墨烯和石墨烯量子点之间的距离，使得石墨烯量子点的电致化学发光被猝灭。蛋白激酶的浓度越大，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装于传感界面的氧化石墨烯就越多，对石墨烯量子点的电致化学发光猝灭效应越强，实现了对蛋白质激酶的高灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用，属于电致化学发光领域；它先将壳聚糖滴涂于电极表面，通过共价作用先后将石墨烯量子点和多肽组装到电极表面；在蛋白激酶和三磷酸腺苷的作用下，多肽发生磷酸化，通过抗原-抗体之间的特异性识别作用，磷酸化抗体共轭的氧化石墨烯被组装到多肽的磷酸化丝氨酸位点上，拉近了氧化石墨烯和石墨烯量子点之间的距离，使得石墨烯量子点的电致化学发光被猝灭。蛋白激酶的浓度越大，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装于传感界面的氧化石墨烯就越多，对石墨烯量子点的电致化学发光猝灭效应越强，实现了对蛋白质激酶的高灵敏检测。【专利说明】基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用
本专利技术涉及电致化学发光领域，尤其涉及一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用。
技术介绍
石墨烯是一种二维自由态原子晶体，它是构筑维富勒烯、一维碳纳米管、三维体相石墨等SP2杂化碳的基本结构单元，自2004年首次报道以来，引起了国内外研究者们的极大关注。石墨烯优良的电化学、力学和热力学性质，使得其广泛应用于聚合物材料、传感器、与能量相关的材料和场效应晶体管等研究。然而，石墨烯是一种零带隙材料，很难观察到其发光现象。因此，运用各种方式处理石墨烯的带隙并拓展其发光应用，引起了科学家极大的研究兴趣，如，通过掺杂打开石墨烯的带隙，通过部分还原和表面钝化利用氧化石墨烯(GO)，将石墨烯材料腐蚀切割成石墨烯量子点(GQDs)以诱导其光致发光(PL)等。尤其是新发现的GQDs，为电致化学发光(ECL)研究和应用提供了良好材料。然而，迄今为止，GQDs在ECL方面的研究应用非常少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种基于GO和GQDs之间ECL-RET作用的传感器制备方法及激酶检测应用，它制备的传感器具有检测灵敏、选择性好和稳定性好的优点。本专利技术是这样来实现的，一种基于氧化石墨烯和石墨烯量子点之间电致化学发光能量转移(ECL-RET)作用的传感器制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤:(1)采用Hummers方法制备GO:将1.0 g石墨和1.0 g NaNO3加入到46 mL的质量百分浓度为98%的H2SO4中，冰浴下缓慢加入6.0 g KMnO4,于35 ° C水浴中搅拌I h，加入80 mL超纯水，继续搅拌30 min，再加入200 mL超纯水后，逐滴加入6 mL的质量百分浓度为30%的H2O2，室温下反应I h ;将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，将产物分散到500 mL超纯水中，超声处理2 h，即制得均匀分散的GO ； (2)利用水热法制备GQDs:将干燥的GO置于管式炉中，在N2保护的条件下，以5° C/min的升温速率加热到200 ° C并保持2 h，得到石墨烯片；将0.05 g石墨烯片加入到体积比为1:3的浓硫酸:浓硝酸的混合溶液中超声17 h，加入250 mL超纯水稀释；用0.22 Mm微孔滤膜过滤，将收集的滤饼悬浮在40 mL超纯水中，用NaOH调节溶液pH为8后，转移入反应釜中于200 ° C反应12 h，冷却到室温；用0.22 Mffl的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为GQDs溶液；所述的浓硫酸的质量百分浓度为98%，浓硝酸的质量百分浓度为68% ； (3)羧基化GQDs的制备:将0.05 g的NaOH和0.1 g的氯乙酸钠加入到20 mL的GQDs溶液中，超声反应3 h，用盐酸调节溶液pH为中性，即得到羧基化的GQDs ； (4)抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯(Ab-GO)复合物的制备:将200μ?Λ mg/mL的GO和200 μ?、5 Pg/mL的抗磷酸化丝氨酸抗体(Ab)混合，室温条件下反应12 h ;将产物在10000 rpm下离心30 min，用超纯水清洗3次，将产物重悬于10 mM、pH 7.4的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，4 °(:下保存； (5)ECL传感器的制备:玻碳电极先在粒径为1.0，0.3，0.05 Mm的Q-Al2O3糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗I min。将10 μ L、质量百分浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干后，将电极浸入到含有5 mM的N-乙基-N’ -1-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的羧基化GQDs溶液中，室温下孵化5 h ;用10 mM、pH 7.4的PBS缓冲溶液清洗后，将电极插入到含有5 mM的EDC、8 mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50 μ M的多肽溶液中反应3 h ;再将电极插入到含有蛋白激酶(CK2)和三磷酸腺苷(ATP)的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)缓冲溶液中反应2 h，使多肽发生磷酸化；将磷酸化多肽修饰电极在Ab-GO复合物溶液中孵化I h，即制得ECL传感器；上述步骤中，所述的壳聚糖溶液的配制方法为将壳聚糖加入到质量百分比为1%的醋酸溶液中并超声溶解。所述的Tris缓冲溶液的浓度为20 mM, pH为?.4，包含20 mM的MgCl2。激酶检测应用是指传感器对蛋白激酶活性及其抑制剂的检测:随着CK2浓度的增加，多肽修饰电极表面产生的磷酸化位点越多，组装到GQDs修饰电极表面的GO就越多，在含有0.1 M Na2S2O8和0.1 M KCl的PBS缓冲溶液中，电极表面捕获的GO对GQDs的电致化学发光产生的猝灭效应越强，使得ECL信号逐渐下降，0(2浓度在0.01-5 U/mL范围内与ECL信号呈线性关系，对CK2的检测限为0.023 U/mL ；ECL强度随着CK2抑制剂浓度的增大而增强，当鞣花酸浓度为0.15 μΜ时，ECL信号达到最大，计算得到的鞣花酸的半抑制浓度为0.043 μΜ。所述的PBS缓冲溶液的浓度为0.1 M，pH为7.4。本专利技术的技术效果是:本专利技术利用GO与GQDs之间的电致化学发光能量转移，使得GO对GQDs的电致化学发光产生猝灭，构建了一种用于对蛋白激酶活性及其抑制剂检测的ECL生物传感器，此传感器具有高灵敏度、检测限低和稳定性好等特点。【专利附图】【附图说明】`图1是ECL生物传感器检测CK2活性和抑制剂的原理图。图2是(A)GO和(B)GQDs 的透射电微镜图；(C)(a) GO、(b) GQDs 和(c) GQDs-COOH的FTIR图；(D) GQDs-COOH的(a)紫外吸收光谱和(b)荧光光谱，内插图为GQDs (I, 2)和GQD-C00H (3，4)在可见光(1，3)和紫外光(2，4)下的对比图。图3是(a)玻碳电极，(b) CS、(c) GQDs/CS、(d)多肽/GQDs/CS修饰电极以及电极⑷在(e)磷酸化前和(f)磷酸化后在含0.1 M Na2S2O8和0.1 M KCl的PBS (0.1 Μ,ρΗ7.4)中的ECL强度-电位图。扫描速率为100 mV/s，光电倍增管的电位为800 V。图4 是(a)玻碳电极，(b) CS、(c) GQDs/CS、(d)多肽 /GQDs/CS、(e)磷酸化多肽 /GQDs/CS和(f) GO-Ab/磷酸化多肽/GQDs/CS修饰玻碳电极在含有5 mM的本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于GO和GQDs之间ECL?RET作用的传感器制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：（1）采用Hummers方法制备氧化石墨烯：将1.0?g石墨和1.0?g?NaNO3加入到46?mL的质量百分浓度为98%的H2SO4中，冰浴下缓慢加入6.0?g?KMnO4，于35?°C水浴中搅拌1?h，加入80?mL超纯水，继续搅拌30?min，再加入200?mL超纯水后，逐滴加入6?mL的质量百分浓度为30%的H2O2，室温下反应1?h；将产物趁热过滤并用超纯水清洗至滤液为中性，将产物分散到500?mL超纯水中，超声处理2?h，即制得均匀分散的氧化石墨烯；（2）利用水热法制备石墨烯量子点：将干燥的氧化石墨烯置于管式炉中，在N2保护的条件下，以5?°C/min的升温速率加热到200?°C并保持2?h，得到石墨烯片；将0.05?g石墨烯片加入到体积比为1:3的浓硫酸:浓硝酸的混合溶液中超声17?h，加入250?mL超纯水稀释；用0.22?μm微孔滤膜过滤，将收集的滤饼悬浮在40?mL超纯水中，用NaOH调节溶液pH为8后，转移入反应釜中于200?°C反应12?h，冷却到室温；用0.22?μm的微孔滤膜过滤除去大体积的石墨烯片，得到的棕色滤液即为石墨烯量子点溶液；（3）羧基化石墨烯量子点的制备：将0.05?g的NaOH和0.1?g的氯乙酸钠加入到20?mL的石墨烯量子点溶液中，超声反应3?h，用盐酸调节溶液pH为中性，即得到羧基化的石墨烯量子点；（4）抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯复合物的制备：将200?μL、1?mg/mL的氧化石墨烯和200?μL、5?μg/mL的抗磷酸化丝氨酸抗体混合，室温条件下反应12?h；将产物在10000?rpm下离心30?min，用超纯水清洗3次，将产物重悬于10?mM、pH?7.4的磷酸盐缓冲溶液中，4?oC下保存；（5）ECL传感器的制备：玻碳电极先在粒径为1.0，0.3，0.05?μm的α?Al2O3糊中抛光，再用乙醇和水超声清洗1?min；将10?μL、质量百分浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴涂到玻碳电极表面并晾干后，将电极浸入到含有5?mM的N?乙基?N’?1?(3?二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的羧基化石墨烯量子点溶液中，室温下孵化5?h；用10?mM、pH?7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗后，将电极插入到含有5?mM的N?乙基?N’?1?(3?二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、8?mM的N?羟基琥珀酰亚胺和50?μM的多肽溶液中反应3?h；再将电极插入到含有蛋白激酶和三磷酸腺苷的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中反应2?h，使多肽发生磷酸化；将磷酸化多肽修饰电极在抗磷酸化丝氨酸抗体氧化石墨烯复合物溶液中孵化1?h，即制得ECL传感器。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邱建丁，向彩云，梁汝萍，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：