含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库制造技术

本发明专利技术公开了一种含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性致癌物的检测。结合流式细胞仪分选技术、深度测序技术建立一种高通量筛选遗传毒性相关易感基因的方法。本发明专利技术的优点在于，可以检测遗传毒性化合物，且高通量，针对性强，操作简便。这种以遗传毒性检测灵敏度检测为基础的筛选与遗传毒性效应相关的易感基因群的文库，其应用前景：一方面可作为分子工具研究这类影响检测系统灵敏的基因的遗传表达与外源遗传毒性化合物的暴露间的相互作用关系，另一方面可通过生物信息学分析，可将酵母的遗传毒性相关易感基因与人类的癌症易感基因建立关联，为提高环境健康风险评价水平提供新方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性致癌物的检测。结合流式细胞仪分选技术、深度测序技术建立一种高通量筛选遗传毒性相关易感基因的方法。本专利技术的优点在于，可以检测遗传毒性化合物，且高通量，针对性强，操作简便。这种以遗传毒性检测灵敏度检测为基础的筛选与遗传毒性效应相关的易感基因群的文库，其应用前景：一方面可作为分子工具研究这类影响检测系统灵敏的基因的遗传表达与外源遗传毒性化合物的暴露间的相互作用关系，另一方面可通过生物信息学分析，可将酵母的遗传毒性相关易感基因与人类的癌症易感基因建立关联，为提高环境健康风险评价水平提供新方法。【专利说明】含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库
本专利技术涉及生物技术，尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性化合物的检测。
技术介绍
酿酒酵母是一种简单真核生物，单细胞，遗传改造操作简单，培养简便快速且环境友好，适合作为一种模式生物应用于生命科学研究。1996年酿酒酵母全基因组序列分析作为第一个真核生物全基因组序列信息被公布，约有5800个基因序列信息被获得而其中大约有23%基因与人类同源，因此酿酒酵母作为一种简单的模式生物因其已知的全基因组序列信息可为深入研究真核生物乃至高等生物生命机制提供基础。基于已知的酿酒酵母全基因组序列，斯坦福大学研究人员为主的多个实验室构建得到酿酒酵母单基因缺失株文库(Saccharomyces Genome Deletion Project) (Giaeveret al., Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiaegenome，2002，Nature418(6896):387-391.)，该文库以野生型酿酒酵母菌株作为背景菌株，利用以PCR为基础的基因敲除策略(PCR-based gene deletion strategy),根据基因同源重组原理逐个对酿酒酵母基因组中的每一个基因进行敲除，最后共得到5396个分别单基因敲除的突变株。由PCR介导的基因敲除策略，即将酵母基因组中每个基因的开放阅读框(ORF)被卡那霉素抗性基因(KanMX)同源重组置换，并利用G418抗性对基因敲除菌进行筛选。PCR扩增KanMX基因所用到的引物由四部分组成，其中包括(I)酵母目的基因ORF片段前ISbp同源序列；(2)18bp通用引物U1、D1 ;(3)—段20bp长度的仅标示、鉴定目的缺失基因的特异条形码序列(barcoding sequence),即每一个酵母基因都对应一条特异性条形码序列；(4) 18bp与KanMX基因同源的序列。目前该文库的应用主要是建立一种合成致死筛选微阵列(Syntheticgenetic array, SGA)方法即通过检测细胞生长速率和致死性来研究酵母中基因功倉泛及分子机制(Baryshnikova et al, Synthetic Genetic Array (SGA) Analysis inSaccharomyces Cerevisiae and Schizosaccharomyces Pombe, 2010, Meth ods inEnzymology, Vol470: Guide to Yeast Genetics: 470:145-179.)并应用于一些化合物毒性的分析。而Boone等人利用SGA手段已绘制了酿酒酵母全基因组范围内的双基因缺失遗传相互作用图谱(Boone et al., The genetic landscape of a cell, 2010, FebsJournal277:7-8.)，其中可定量分析基因间相互作用的基因占全基因组的75%，为酿酒酵母遗传相互作用的研究提供了一个高通量、覆盖面全、意义重大的有力工具。但是这种以致死性为检测指标的分析，限制了对一些化合物的非致死性生物毒性的检测和分析，比如一些遗传毒性化合物，它们可能不会致死，但具有DNA损伤效应。如果将DNA损伤响应的生物传感器转入到酵母单基因缺失文库中，将会扩展文库的应用范围，开展高通量、特异性遗传毒性化合物易感基因群的筛选。基于酵母DNA损伤响应的生物传感器是一种用于检测环境遗传毒性化合物的检测系统，该类型生物传感器的构建需具备以下两个基本元件:感应元件和连接于此后的效应元件。前者利用其自身功能可对DNA损伤进行响应，并开启后者的表达，从而产生可检测出的信号。基于酵母DNA损伤响应的生物传感器RNR3-yEGFP (专利申请号201210269407.5)、酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统HUGl-yEGFP (专利申请号201210263302.9)即分别利用RNR3、HUG1两种基于DNA损伤转录应答的基因启动子作为生物传感器的感应元件，yEGFP酵母增强型绿色荧光蛋白作为效应元件构建而成，这两种生物传感器可检测多种遗传毒性致癌物，可应用于高通量的遗传毒性致癌物环境实时现场监测。将酵母DNA损伤响应的生物传感器转入酵母单基因缺失文库已具备成熟的方法。由于酿酒酵母单倍体结合型可分为MATa和MATa两种，这两种结合型的酵母单倍体可进行杂交，杂交后的双倍体酿酒酵母细胞通过有丝分裂产生四个子囊孢子，再通过一系列抗性、营养型标签筛选可将外源质粒、细胞转入酵母单基因缺失文库中形成新的分子功能(具体转化构建方法见 Kainth et al., Comprehensive genetic analysis oftranscription factor pathways using a dual reporter gene system in buddingyeast.Methods, 2009, 48:258 - 264)，因此可利用该技术手段对现有的酵母单基因缺失文库进行遗传改造。含有绿色荧光报告基因的生物传感器酵母可以用流式细胞仪进行检测和分选。流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测技术手段，可以高速分析大量细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，其应用范围非常广泛。其中细胞分选功能是流式细胞仪的重要应用之一，即含有荧光标记或染色的样品细胞悬液上机后，在高压作用下被仪器流动室中的鞘液所包裹，并有序排列，在超声振荡器的作用下含有样品细胞的液流被振荡成为一个个包裹细胞的小液滴，根据荧光强度信号的选择，仪器赋予所需分选的细胞一定正或负电荷，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生不同角度偏转后，达到了分离细胞的目的；它能够根据每个细胞的光散射和荧光特性`，将特定的细胞从细胞群体中分选出来，因此流式细胞技术是分析细胞特性的一个应用手段。具有不同荧光强度的酵母细胞意味着所具有的缺失基因对暴露的遗传毒性化合物的响应灵敏度不同，通过对其所具有的缺失基因的特异条形码序列的测定，就可以鉴定缺失基因的种类。DNA测序开始于上世纪70年代，第一代DNA测序技术以末端终止法为核心，又称之为化学测序法(Sanger法)，成型于上世纪80年代。近年来，本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，其特征在于，该文库用高通量酵母单倍体结合型杂交筛选方法分别将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器RNR3?yEGFP和酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统HUG1?yEGFP转入酿酒酵母单基因缺失文库中，获得两个分别含有RNR3?yEGFP和HUG1?yEGFP遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴和平，萧伟，魏婷，汤花梅，张超，许鑫，袁丽，张晓华，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：