本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，其中上、下游引物如SEQIDNO:1~2所示，探针P1：SEQIDNO:3，探针P2：SEQIDNO:4，且探针1和探针2序列的3’端结合荧光淬灭基团，探针P1和探针P2序列的5’端结合不同的荧光报告基团。该引物特异性和灵敏度都较高，且能够检测出变异的PEDV，可以对各种临床样品进行检测、鉴别，从而可以快捷地对流行的PEDV毒株进行区分，操作简单、实用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，其中上、下游引物如SEQIDNO:1~2所示，探针P1：SEQIDNO:3，探针P2：SEQIDNO:4，且探针1和探针2序列的3’端结合荧光淬灭基团，探针P1和探针P2序列的5’端结合不同的荧光报告基团。该引物特异性和灵敏度都较高，且能够检测出变异的PEDV，可以对各种临床样品进行检测、鉴别，从而可以快捷地对流行的PEDV毒株进行区分，操作简单、实用。【专利说明】猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种可以区分变异和经典猪流行性腹泻病毒的双重荧光定量PCR引物和探针。
技术介绍
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹?写病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种猪肠道传染病，以水样腹?写、呕吐和脱水为特征(Takahashi K，Okada K，OhshimaK.An outbreak of swine diarrhea of a new type associated with coronavirus-1ikeparticles in Japan.Vet Sci, 1983, 45:829-832; Murphy FA, Fauquet C M.smithReport of the ICTV, Archives virology suppl, 1995, 10: 407-409.;殷震，刘景华.动物病毒学.2版.北京:科学出版社，1997.681-688.)。各种日龄的猪均可感染，哺乳仔猪、断奶仔猪的发病率可达100%，尤其哺乳仔猪受害最为严重，此病多发生于寒冷季节。20世纪70年代最初发现于英国(李连敏，裴爱民.秋冬季谨防猪流行性腹泻病.南方养猪，2006，209: 44.;林初文，庄金秋，谢印乾.我国主要猪病毒性腹泻疾病的特点及其防治对策.中国畜牧兽医，2007，34 (5): 121-122.)。随后，许多国家如比利时、德国、加拿大、法国、日本等国也都出现了 PED流行的报道(蔡宝祥.介绍几种新近发现的猪传染病.畜牧与兽医，1982，5: 218-221.；Pensaert M B, de Bouck P.A newcoronavirus-1ike particle associated with diarrhea in swine.Arch Viorl,1978，58:237-243.)，我国从20世纪80年代初开始陆续有本病的流行报道，并且给我国的养猪业带来了巨大的损失(倪艳秀，林继煌，何孔旺等.猪流行性腹泻研究概况〔J].畜牧与兽医，2001，33 (I): 38-40.)。PEDV属于冠状病毒属I群，是RNA病毒，基因组为单股正链，不分节段。基因组包含6个开放读框(ORF)，从5’到3’顺序依次为ORFl (20346 nt) ；S基因(4152 nt)；0RF3 基因(675 nt)；E 基因(231 nt)；M 基因(681 nt)和 N 基因(1326 nt) (Kocherhanset al., Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genomesequence.Virus Genes.2001, 23(2): 13-144.; Brian et al., Coronavirusgenome structure and replication.Curr Top Microbiol Tmmunol.2005, 287:1~30.)。目前针对PEDV的实验室诊断方法有病原学方法、基于病毒抗原或抗体的免疫学方法和针对病毒RNA核酸检测技术(邓小红，吕立新，陶庆园等.猪病毒性腹泻病的实验室诊断.畜禽业，2004，165 (I): 49-50.)。传统的病原学方法主要通过细胞进行病毒的分离，耗时、耗力。用免疫学检测抗体可以了解病毒感染以及疾病发生、发展的过程，然而，由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，因此抗体检测在作为快速防控的方法时存在一定局限性。荧光定量PCR以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快的诸多优点成为分子生物学研究中的重要工具。目前，PEDV在中国大陆仍然存在大规模发生的情况，给中国的养猪业带来巨大损失。有学者对此次流行的PEDV毒株以及其基因变异情况进行了详细的分析(Pan Y et al.，Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus inChina , Virol J.2012, Sep 12; 9:195.)，发现变异毒株和经典PEDV毒株之间S基因有较大的不同，可以作为区分两种毒株的特征基因，但目前还未有针对此的荧光定量鉴别诊断方法出现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的上述问题，通过对猪流行性腹泻病毒S基因的分析，设计引物和两个不同报告基团标记的探针(变异PEDV为FAM，经典PEDV为HEX)，并建立了荧光定量PCR方法，可以对变异和经典猪流行性腹泻病毒进行快速的鉴别区分。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的: 一种猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，序列如下: 上游引物 F:GTTCTTTTCAAAATTTAATGTKCAGG (SEQ ID NO:1); 下游引物 R:CTTGCGAAATGCCAATCTCA (SEQ ID NO:2); 探针 Pl:CTTGGTACTGTGCTGGCCAACATCC (SEQ ID N0:3)； 探针 P2:TCTTCTAGCTGGTACTGTGGCACAGGC (SEQ ID N0:4)； 其中，探针I和探针2序列的3 ’端结合荧光淬灭基团，探针I和探针2序列的5’端结合不同的突光报告基团。根据NCBI登陆的猪流行性腹泻病毒基因组序列，登录号:变异毒株(JN825712，JX088695, JX188454, JX489155, JX261936, JX112709, JX524137, JQ282909)和经典毒株(AF353511，EF185992，Z25483，JQ023161, JN547228)提供的信息，经过比对分析，设计了以上定量PCR的引物和探针，使用上述引物进行荧光定量PCR扩增，可以通过扩增曲线鉴别经典和变异猪流行性腹泻病毒，省去测序的步骤，节省了时间和成本。提取待检测样品中的RNA，经反转录后使用引物F、R和探针P1、P2进行荧光定量PCR扩增。如果探针Pl的荧光报告基团有扩增曲线出现的即是变异PEDV，探针P2的荧光报告基团有扩增曲线出现的即是经典PEDV，若是均无扩增曲线产生，则说明样品中不含PEDV0其中扩增曲线CT值小于35的判断为阳性，CT值大于35而小于40的判断为可疑，需重复试验。第二次CT值仍在这个范围的判断为阳性。作为优选方案，上述猪流行性腹泻病毒的荧光定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，序列如下：上游引物F：SEQ?ID?NO:1；下游引物R：SEQ?ID?NO:2；探针P1：SEQ?ID?NO:3；探针P2：SEQ?ID?NO:4；其中，探针1和探针2序列的3’端结合荧光淬灭基团，探针P1和探针P2序列的5’端结合不同的荧光报告基团。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：王东东，宋延华，周庆丰，潘永飞，李春梅，田小艳，卢围，廖承球，
申请(专利权)人：广东温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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