本发明专利技术公开了一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒。本发明专利技术采用环介导等温扩增（LAMP）技术，根据鸭甲肝病毒3D基因的保守序列设计一对外引物和一对内引物（如SEQ?NO.1-4），建立鸭甲肝病毒的检测试剂盒，包含以下成分：TRIZol；反应液；SYBR?Green?Ⅰ；阳性对照；DEPC处理水。本发明专利技术试剂盒具有操作简便、检测快速、敏感性高、特异性好等优点，特别是对仪器的要求低，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒。本专利技术采用环介导等温扩增（LAMP）技术，根据鸭甲肝病毒3D基因的保守序列设计一对外引物和一对内引物（如SEQ?NO.1-4），建立鸭甲肝病毒的检测试剂盒，包含以下成分：TRIZol；反应液；SYBR?Green?Ⅰ；阳性对照；DEPC处理水。本专利技术试剂盒具有操作简便、检测快速、敏感性高、特异性好等优点，特别是对仪器的要求低，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。【专利说明】—种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒
本专利技术涉及一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒，专用于鸭甲肝病毒的诊断，属于生物
。
技术介绍
鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)引起的鸭病毒性肝炎是影响我国养鸭业发展的主要疾病之一。该病毒主要感染3周龄内的雏鸭，感染率高、发病快、死亡率高，若不及时治疗，死亡率可达50%以上。该病波及面广、发病率高、危害严重，每年都会给我国的养鸭业造成严重的经济损失。鸭甲肝病毒分为A、B、C三个基因型，它们之间无抗原交叉性，目前在我国流行的主要是A型和C型。对于鸭甲肝病毒的实验室诊断，可以采取传统的血清中和实验，但该方法存在耗时长、不易标准化等缺点。也可以采取快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术，如RT-PCR、荧光定量PCR等，但这些方法需要PCR仪或者荧光定量PCR仪、电泳系统等较为复杂的仪器设备，大多数小型或个体的养殖场，缺乏此类硬件条件，使得这些方法的推广与应用受到限制。环介导等温扩增(LAMP)技术是一种新的体外扩增特异性基因的分子生物学方法。该方法只需要简单的水浴锅，在30-90min内即可扩增大量的目的基因，而且可以不需要核酸电泳的方法来判断结果，仅通过在紫外线下肉眼观察就能判断结果。LAMP检测技术具有操作简便、检测快速、高效实用等优点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用L AMP技术建立一种鉴别鸭甲肝病毒通用的检测试剂盒，该试剂盒具有快速、准确、敏感性高、特异性好、成本低等特点，完全能够满足基层现场快速检测鸭甲肝病毒感染的需要。本专利技术的技术方案是:一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒，其特征是，包括以下组分(50次量):I)TRIZol:50ml ；2)反应液:2000 μ L，包括 IOXBst buffer250 μ L、dNTP(10mmol/L) 100 μ L、MgCl2(25mmol/L)300y L, betaine (5mol/L) 200 μ L、外引物 DHV-F3、DHV-B3 (10 μ mol/L)各50μ L、内引物 DHV-FIP、DHV-BIP (40 μ mol/L)各 100 μ L、RNA 酶抑制剂(40U/μ L) 100 μ L、反转录酶 AMV (5U/ μ L) 100 μ L、Bst DNA 聚合酶(8U/ μ L) 100 μ L、DEPC 处理水 550 μ L ；3) SYBR Green I:100μ L ；4)阳性对照:重组质粒T-DH250 μ L，浓度为0.1ng/ μ L ；5) DEPC 处理水:1ml。上述试剂除SYBR Green I购自Invitrogen公司外，其余均购自大连宝生物(TAKARA)公司。所述检测引物DHV-F3、DHV-B3、DHV-FIP, DHV-BIP 依次为:DHV-F3:5’-ATCTGGYTGTGCTGTTGGRAT-3’ (SEQ N0.1)DHV-B3:5’-CATARCAYTGRTTGATGTCATAKCC-3’ (SEQ N0.2)DHV-FIP:5’-ACTCARAGABCCATCRAAWCCAGTTTTGAGTGGGAYAATYTGTTRGC-3’ (SEQN0.3)DHV-BIP: 5' -CHCAYTATGTAACTGATGAGATHTGGTTTTACAGTRGTRCAKGGDGAT CCTGA-3’(SEQ N0.4)(R = A^G；Y = C^T；H = A, T^C ；D=G, A或T;W = A或T;B = G，T 或C;K =G或T)所述重组质粒T-DH的详细制备方法:按照TRIZol试剂说明提取A型鸭甲肝病毒RNA，利用引物DHV-F3/DHV-B3进行RT-PCR，扩增目的条带，反应条件如下:RT 反应体系(20μ L):10mmol/L dNTPl.0 μ L、5 X RT 缓冲液 4.0 μ L、20pmol/μ L 的引物 DHV-B31.0 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制剂 0.5 μ L、RNA 模板 I μ L、DEPC 水 11.5 μ L ;置于PCR扩增仪进行反应，5U/ μ L反转录酶AMVl μ L于70°C 5min后加入；反应程序:70°C 5min，42°C 30min,95°C 2min。PCR 反应体系(50μ L):ddH2039y L、20pmol/y L 的引物 DHV-F31.0 μ L、10XPCR缓冲液4.5 μ L、5U/ μ L Taq DNA聚合酶0.5 μ L、RT产物5.0 μ L ;置于PCR扩增仪进行反应，反应程序:95°C 2min预变性；94°C变性15sec、60°C退火15sec、72°C延伸20sec，共30个循环；72°C 延伸 5min。回收目的条带，与载体pMD18-T连接，转化DH5a感受态细胞，提取质粒，PCR鉴定阳性后送上海博尚生物工程有限公司测序。序列正确的质粒标记为T-DH作为鸭甲肝病毒的阳性对照。所述检测试剂盒的操作步骤:1)RNA提取:取200 μ L待检鸭病料匀浆液，加入Iml TRIZol，充分震荡，静置IOmin后加入200 μ L氯仿,充分混匀,静置5min后，12000rpm离心IOmin,取上清加入等体积的异丙醇，充分混匀后，放_20°C静置Ih以上。然后12000rpm离心15min，弃掉上清，加入75%酒精500 μ L，12000rpm离心5min，弃掉上清，RNA沉淀干燥后加入10 μ L DEPC处理水，备用；2) LAMP反应:取20 μ L反应液，加入5 μ L待检RNA，混匀后按下面的程序进行反应:6(TC 90min,85°C 2min ；3)阳性对照:取20 μ L反应液，加入5μ L阳性对照物，混匀后按下面的程序进行反应:60°C 90min，85°C 2min ；4)结果判断:可采取两种方法判断结果。一是电泳观察:取5 μ L PCR产物加入1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳观察，若出现阶梯状条带，可判断为鸭甲肝病毒阳性；若未出现，则可判断为鸭甲肝病毒阴性。二是肉眼观察:反应结束后，取I μ L SYBR Green I加入产物中，混匀后在紫外线下观察结果。若有白色荧光，可判断为鸭甲肝病毒阳性；若无，则可判断为鸭甲肝病毒阴性。本专利技术具有下列优点:1.本专利技术建立的LAMP检测方法对鸭甲肝病毒RNA的最低检出量为0.lpg，敏感性比RT-PCR方法提高10倍；2.本专利技术建立的LAMP检测技术具有操作简便、检测快速、高效实用等优点，特别是对仪器的要求低，非常本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒，其特征是，它包括下述引物：正向外引物DHV?F3：5“?ATCTGGYTGTGCTGTTGGRAT?3“；反向外引物DHV?B3：5“?CATARCAYTGRTTGATGTCATAKCC?3“；正向内引物DHV?FIP：5“?ACTCARAGABCCATCRAAWCCAGTTTTGAGTGGGAY?AATYTGTTRGC?3“；反向内引物DHV?BIP：5“?CHCAYTATGTAACTGATGAGATHTGGTTTTACAGTRGT?RCAKGGDGAT?CCTGA?3“；其中R＝A或G；Y＝C或T；H＝A,T或C；D=G,A或T；W＝A或T；B＝G,T或C；K＝G或T。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于可响，黄兵，李玉峰，马秀丽，史玉颖，姜亦飞，林树乾，宋敏训，李峰，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：
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