本发明专利技术公开了一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，包括：步骤1）酵母目标突变体的获得；步骤2）多重逆境筛选；步骤3）候选基因测序；步骤4）抗多重逆境检验。本发明专利技术根据异源功能互补、利用对各种逆境条件均敏感的酵母突变体，快速筛选出植物cDNA文库中对多种逆境都具有抗性的抗逆基因。可在短时间内筛选出大量与植物多重逆境抗性相关的基因，且实验成本低、操作程序简单、稳定性好、效率高。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括：步骤1）酵母目标突变体的获得；步骤2）多重逆境筛选；步骤3）候选基因测序；步骤4）抗多重逆境检验。本专利技术根据异源功能互补、利用对各种逆境条件均敏感的酵母突变体，快速筛选出植物cDNA文库中对多种逆境都具有抗性的抗逆基因。可在短时间内筛选出大量与植物多重逆境抗性相关的基因，且实验成本低、操作程序简单、稳定性好、效率高。【专利说明】
本专利技术属于遗传工程领域，涉及，具体涉及一种根据异源功能互补、利用对各种逆境条件均敏感的酵母突变体，快速筛选出植物CDNA文库中对多种逆境都具有抗性的抗逆基因的方法。
技术介绍
近年来，由于环境变化加剧，对世界范围内的作物生长带来了巨大的影响。据统计，在世界范围内，适于耕种的土地不足10%，大部分土地处于干旱、高温、低温、盐碱、重金属等逆境中。而且，因人口的不断增长对粮食需求的压力越来越大，迫切需要培育出能在各种非生物胁迫下生长的经济作物。在植物抗逆性研究中，目的不仅在于从分子水平上解释植物适应逆境的机制，而且更希望获得各种抗逆基因，用于作物的抗逆育种。目前，已获得了许多与非生物胁迫抗性有关的基因，为植物抗逆性的生物工程提供了可靠的理论依据和实践基础。对植物抗逆性的分子机制研究表明，植物的抗逆性是由多基因控制的，而且植物生长在自然界中，往往处于多种逆境条件的共同胁迫下，多种非生物胁迫的同时出现对植物来说是最致命的，最有效应对的方法是找出调控逆境组合反应的基因。目前，分离抗逆基因的方法很多，但或多或少都存在一些不足。如mRNA差异显示方法，假阳性比例高；cDNA文库的差示筛选，容易找到表达量高的基因，很难找到低拷贝数、低表达的基因；图位克隆法，准确率高，但是代价昂贵，操作复杂。最主要的是，这些方法一般仅能得到与某种特定胁迫相关的若干基因，基因数量有限，并且只是针对那些遗传背景和基因组信息齐全的植物。如果能够快速筛选出非模式抗逆植物资源中的多重逆境抗性相关的大量基因，将具有非常重要的意义。酵母作为研究高等真核生物的一种重要的模式生物，不仅在生物信息学方面发挥着重要的作用，其丰富的突变体在其他生物基因克隆和功能验证等方面也发挥着重要的作用。多重逆境单细胞筛选酵母异源互补方法是利用对各种逆境组合敏感的酵母突变体，来建立异源功能互补筛选平台，筛选植物体内控制逆境组合的新基因，将在植物抗逆基因的筛选中发挥重要作用，为高等真核生物的基因克隆提供了一种捷径。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供，以克服现有技术的不足，快速筛选出抗11202、211(:12』(1(:12、似(:1及耐高温、耐低温的植物多重逆境抗性基因，该方法具有成本低、操作程序简单、筛选效率高、稳定性好等优点。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案来实现。，包括如下步骤:步骤I)酵母目标突变体的获得将酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突变体库的各种突变体,接种于YPD液体培养基中，30°C过夜培养，转入新鲜YPD液体培养基，至分裂2代。收集处于对数生长期的细胞(OD6tltl=0.4~0.6)，10倍梯度稀释5次，分别置于含0.5-2.0mmol/L H2O2,20-80mmol/L ZnCl2,50-250mmol/L CdCl2、150-350mmol/L NaCl 的 YPD 固体培养基中培养，及分别在高温37°C、低温15°C、正常条件(30°C)下置于YPD固体培养基中培养；从中筛选出对上述逆境条件均敏感的酵母菌株突变体AHogl,作为文库筛选的宿主菌株。步骤2)多重逆境筛选用植物cDNA文库转化步骤I)中筛选出的突变体菌株AHogl得到酵母转化子，并培养于含0.25-1.0mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基上。挑取生长出的单克隆，培养于含0.25-1.0mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基上。将生长状态良好的酵母转化子分别培养于含 0.25-1.0mmol/L H202、5-15mmol/L ZnCl2,20-100mmol/L CdCl2、100-350mmol/L NaCl的营养缺陷型SD固体培养基上，及分别在高温37°C、低温15°C、正常条件(30°C)下置于营养缺陷型SD固体培养基中培养。步骤3)候选基因测序提取步骤2)中在上述各种逆境条件下都生长良好的酵母转化子质粒，进行测序，所得植物基因进行抗多重逆性检验。步骤4)抗多重逆性检验选取缺失步骤3)中所得植物基因的植物突变体，与植物野生型同时培养于分别含有 1.0-15mmol/L H202、100_450umol/L ZnCl2、50-350mmol/L CdCl2、50-300mmol/L NaCl、的MS固体培养基，及在高温37°C、低温15°C、正常条件22°C下置于MS固体培养基。如果该植物突变体的生长状态差于植物野生型，则步骤3)测序得到的基因即为该植物的多重逆境抗性基因。进一步，所述植物为拟南芥，但不局限与该植物，水稻、二穗短柄草、小麦、大豆、杨树等多种植物均可适用于该方法，从而筛选出这些植物中与多重逆境抗性相关的基因。所述拟南芥中多重逆境抗性基因为富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。所述植物的多重逆境抗性基因是指植物中与抗H2O2、ZnCl2、CdCl2、NaCl及抗高温、低温环境相关的基因。优选地，步骤I)中，YPD固体培养基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl浓度分别为1.0-2.0mmol/L、30_60mmol/L、100-250mmol/L、200-350mmol/L。更优选地，步骤I)中，YPD固体培养基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl浓度分别为 1.5mmol/L、50mmol/L、200mmol/L、300mmol/Lo步骤2)中所述营养缺陷型SD培养基的缺失营养成分为亮氨酸。优选地，步骤2)中，所述营养缺陷型SD培养基所加入H2O2浓度为0.5mmol/L,所述营养缺陷型SD固体培养基加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl浓度分别为0.25-0.75mmol/L、7.5-15mmol/L、40-lOOmmol/L、150-300mmol/L。更优选地，步骤2)中，所述营养缺陷型SD固体培养基加入的H202、ZnCl2, CdCl2,NaCl 浓度分别为 0.5mmol/L、10mmol/L、60mmol/L、200mmol/L。优选地，步骤4)中，所述MS固体培养基中加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl的浓度分别为 2.0-10mmol/L、200-400umol/L、100-300mmol/L、100-300mmol/L。更优选地，步骤4)中，所述MS固体培养基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl的浓度分别为 H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl 的浓度分别为 7.5mmol/L、350umol/L、250mmol/L、200mmol/L0本专利技术所用的YPD液体培养基、YPD固体培养基、SD液体培养基、SD固体培养基、MS固体培养基均为市售常规产品。本专利技术所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法从多种酵母突变体中筛本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步骤：步骤1）酵母目标突变体的获得将酵母野生型和各种酵母突变体，接种于YPD液体培养基中，30℃过夜培养，转入新鲜YPD液体培养基，至分裂2代。收集处于对数生长期的细胞（OD600=0.4～0.6），10倍梯度稀释5次，分别置于含0.5?2.0mmol/L?H2O2、20?80mmol/L?ZnCl2、50?250mmol/LCdCl2、150?350mmol/L?NaCl的YPD固体培养基中培养，及分别在37℃、15℃、30℃条件下置于YPD固体培养基中培养；从中筛选出对上述逆境条件均敏感的酵母菌株突变体ΔHog1，作为文库筛选的宿主菌株；步骤2）多重逆境筛选用植物cDNA文库转化步骤1）中筛选出的突变体菌株ΔHog1得到酵母转化子，并培养于含0.25?1.0mmol/L?H2O2的营养缺陷型SD培养基上；挑取生长出的单克隆，培养于含0.25?1.0mmol/L?H2O2的营养缺陷型SD培养基上；将生长状态良好的酵母转化子分别培养于含0.25?1.0mmol/L?H2O2、5?15mmol/L?ZnCl2、20?100mmol/L?CdCl2、100?350mmol/L?NaCl的营养缺陷型SD固体培养基上，及分别在37℃、15℃、30℃条件下置于营养缺陷型SD固体培养基中培养；步骤3）候选基因测序提取步骤2）中在上述各种逆境条件下都生长良好的酵母转化子质粒，进行测序，所得植物基因进行抗多重逆性检验；步骤4）抗多重逆性检验选取缺失步骤3）中所得多重逆境抗性基因的植物突变体，与植物野生型同时培养于含1.0?15mmol/L?H2O2、100?450umol/L?ZnCl2、50?350mmol/L?CdCl2、50?300mmol/L?NaCl、的MS固体培养基及在37℃、15℃、22℃条件下置于MS固体培养基；如果该植物突变体的生长状态差于植物野生型，则步骤3）测序得到的植物基因即为该植物的多重逆境抗性基因。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：储昭庆，李鹏，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：
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