本发明专利技术公开了一种区分鉴定大白菜、结球甘蓝FLCs基因的方法。该方法包括（1）根据已公布的拟南芥、白菜和甘蓝FLCs基因序列，对白菜和甘蓝FLCs基因外显子4和外显子7区段设计引物，合成引物序列；（2）提取不同基因型大白菜和结球甘蓝的基因组DNA，以其为模板进行上述引物的PCR扩增；（3）扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳分离检测；（4）筛选能够区分大白菜、结球甘蓝FLCs基因的引物；（5）利用FLCs基因的特异引物鉴定大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种FLCs基因组成。本发明专利技术实现了对大白菜、结球甘蓝8个FLCs同源基因的全面、有效鉴定，为进一步研究不同FLCs基因对抽薹开花等的作用提供技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。该方法包括（1）根据已公布的拟南芥、白菜和甘蓝FLCs基因序列，对白菜和甘蓝FLCs基因外显子4和外显子7区段设计引物，合成引物序列；（2）提取不同基因型大白菜和结球甘蓝的基因组DNA，以其为模板进行上述引物的PCR扩增；（3）扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳分离检测；（4）筛选能够区分大白菜、结球甘蓝FLCs基因的引物；（5）利用FLCs基因的特异引物鉴定大白菜—结球甘蓝异源三倍体杂交种FLCs基因组成。本专利技术实现了对大白菜、结球甘蓝8个FLCs同源基因的全面、有效鉴定，为进一步研究不同FLCs基因对抽薹开花等的作用提供技术支撑。【专利说明】—种区分鉴定大白菜、结球甘蓝FLCs基因的方法
本专利技术涉及，属于分子遗传学理论应用与育种
。
技术介绍
结球甘蓝为绿体春化型，通常在7、片叶或茎粗达到6mm时才能感受低温，接受61周持续低温才能完成春化诱导开花。大白菜为种子春化型，萌动的种子即可感受低温诱导开花，其春化温度一般也比结球甘蓝高。拟南芥研究结果显示，对春化需求的不同很大程紅mk子FL(XFL(WERING LOCUS CO基因，同时很多控制开花的基因功能也都是通过调节 来实现的，是植物开花研究中的热点。在拟南芥中只有I个拷贝，即位于第5条染色体上。Schranz等(2002)在白菜中克隆到4 AtFLC同源基因-.BrFLCl、BrFLC2、BrFLC3和BrFLC5,在甘蓝中分离到3个J tFLC同源基因-.BoFLCl、BoFLC2和BoFLC5。之后Lin 等(2005)在甘蓝中分离得到 SoZ7ZC1J-J?和。根据 www.ncb1.nlm.nih.gov 和www.brassicadb.0rg/brad/上已公布的白菜和甘蓝/7ZCs基因序列，利用DNAMAN比对与MEGA5.0邻近结合法比较系统发育分析，结果表明BoFLC2与BoFLC4-l的同源性非常高。Okazaki等(2007)在甘蓝中分离得到其结果表明-.BoFLC2与BoFLC4_l的同源性高达98%，推测二者的归类不同是由于Lin等参照了有限的氨基酸序列信息所致。因此本专利技术开展了大白菜、结球甘蓝FLCl、FLC2、FLC3、FLC5的区分鉴定。目前在白菜和甘蓝中分别开展FLCs基因的研究报道很多，但同时开展大白菜和结球甘蓝FLCs同源基因区分鉴定的研究还鲜有报道。仅姚远颞等(2009)以白菜型油菜、甘蓝为材料，利用基因中某碱基差异设计SNP引物对来自白菜型油菜和甘蓝的FLCl与FLC3基因进行了分型(即区分鉴定白菜型油菜和甘蓝的FLC)，每一个基因的分型需要2对引物，没有涉及这一基因家族其他基因。将该SNP特异引物应用到本研究试验材料的鉴别，其中3对引物(FW1-RN2、F3-RC3、F3-RA3)未能得到扩增产物，I对引物(FN2-RW1)扩增得到3500bp左右的非目的扩增产物，即不能用于区分大白菜与结球甘蓝FLCs基因。
技术实现思路
本专利技术以我国广泛种植的不同类型大白菜和结球甘蓝为试材，利用外显子4的多态性区设计正向引物，在外显子7保守区设计反向引物，首次实现了对大白菜和结球甘蓝 BrFLCl、BrFLC2、BrFLC3、BrFLC5、BoFLCl、BoFLC2、BoFLC3 和 BoFLC5 基因的全面、准确鉴定。为进一步探究大白菜(种子春化)与结球甘蓝(绿体春化)春化机制，深入研究每个 基因对抽薹开花的作用，以及大白菜与结球甘蓝同源基因的互作提供技术支撑，为近缘种属同源基因研究提供新思路。本专利技术的基本原理是:利用白菜与甘蓝基因序列，在多态性和保守性区段分别设计正、反向引物，根据扩增产物的大小差异，达到区分鉴定大白菜、结球甘蓝/?&基因的目的。本专利技术的特点是:(1)全面性。区分鉴定了大白菜与结球甘蓝8个同源基因，SPBrFLCl、BrFLC2、BrFLC3、BrFLC5、BoFLC1、BoFLC2、BoFLC3 取 BoFLC5 ；(2)简便性。利用一对引物即可以区分大白菜和结球甘蓝的相应基因；(3)广谱性。本专利技术采用多个类型大白菜和多个类型结球甘蓝为材料，筛选出区分大白菜和结球甘蓝各基因的特异引物，体现了广泛的适用性。本专利技术通过以下步骤完成: (1)根据已发表的的拟南芥、白菜和甘蓝FLCs基因序列，以外显子4的多态性区段(图1)设计正向引物，在外显子7的保守区段(图2)设计反向引物，并合成引物； (2)改良CTAB法提取不同基因型大白菜和结球甘蓝的基因组DNA，以其为模板进行上述引物的PCR扩增，每个PCR反应体系为20 μ L。20 μ L PCR体系为:10XPCR Buffer (含Mg2+) 2M-L ；dNTPs (10mmoL/L) 1.6M-L ；Forward primer (50ng/M-L) IM-L ；Reverse primer(50ng/^L) Iμ? -JagOM 聚合酶(5U/^L)0.2μ? ;模板 DNA (50ηδ/μ?)2μ? ；ddH20 补足 20 μ L。PCR扩增程序为:94°C预变性3min ;94°C变性45s，55~60 °C复性45s，72°C延伸6(T90s，35个循环；72°C延伸8 min，4°C保存； (3)扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳分离检测； (4)筛选出能够区分大白菜、结球甘蓝基因的特异引物，其筛选标准如下:在大白菜和结球甘蓝中分别扩增出与目的基因片段大小一致的扩增产物，且该产物大小在大白菜和结球甘蓝中不同。将符合标准引物的扩增产物回收测序，与已公布的基因比对，确定扩增产物为相应的目的基因片段。特异引物序列见表1。本专利技术以我国广泛种植的大白菜和结球甘蓝为试材，开展抽薹开花关键基因的区分鉴定，其方法实用、步骤具体，适用基因型广泛，重复性好。较已公布的区分白菜型油菜和甘蓝的FLCl与FLC3基因方法简便，且能够区分FLCs全部同源基因，为进一步探究大白菜(种子春化)与结球甘蓝(绿体春化)春化机制，深入研究每个基因对抽薹开花的作用，以及大白菜与结球甘蓝同源基因的互作等研究提供必要的技术支撑。【专利附图】【附图说明】图1为FLCs外显子4部分序列比对结果。图2为FLCs外显子7部分序列比对结果。图3为FLCl特异引物在大白菜、结球甘蓝中的扩增结果。图4为特异引物在大白菜、结球甘蓝中的扩增结果。图5为特异引物在大白菜、结球甘蓝中的扩增结果。图6为/?巧特异引物在大白菜、结球甘蓝中的扩增结果。图3-6中的标号含义是:M1 =Marker DL5000 ;A1:多4 ；A2:新津绿75 ；A3:油绿3号；A4:秋珍白一号；C1:11-1 ；C2:8398 ；C3:蓝宝；C4:晚丰；M2 =Marker DL2000。图7%FLC1特异引物在大白菜一结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本中的扩增结果。图8为ΑΖβ?特异引物在大白菜一结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本中的扩增结果。图9为特异引物在大白菜一结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本中的扩增结果。图10为/?巧特异引物在大白菜一结球甘蓝异源三倍体杂交种及其亲本中的扩增结果。图7-10中的标号含义是:A:多4 ;C: 11_1 ;H:大白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种区分鉴定大白菜、结球甘蓝FLCs基因的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）根据已公布的拟南芥、白菜和甘蓝FLCs基因序列，对白菜和甘蓝FLCs基因外显子4和外显子7区段设计引物，合成引物序列；（2）提取不同基因型大白菜、结球甘蓝基因组DNA，以其为模板进行上述引物的PCR扩增；（3）扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳分离检测；（4）筛选能够区分大白菜、结球甘蓝FLCs基因的引物，其筛选标准如下：在大白菜和结球甘蓝中分别扩增出与目的基因片段大小一致的扩增产物，且该产物大小在大白菜和结球甘蓝中不同；将符合标准引物的扩增产物回收测序，与已公布的FLC基因比对，验证扩增产物为相应的目的基因片段；其中步骤（4）筛选到的用于区分大白菜、结球甘蓝FLC1的引物序列为5“??CTTGAGGAATCAAATGTCGATAA?3“与5“?TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC?3“，用于区分大白菜、结球甘蓝FLC2的引物序列为5“?TAAGCTTGTGGAATCAAATTCTG?3“与5“?ATTTTATCAGCTTCGGCTC?3“，用于区分大白菜、结球甘蓝FLC3的引物序列为5“?GTGGAATCAAATGTCGGTGGT?3“与5“??TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC?3“，用于区分大白菜、结球甘蓝FLC5的引物序列为5“??AATTGTCGATGTAAGCGTGG?3“与5“?TAATTAAGYAGYGGGAGAGTYAC?3“。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：顾爱侠，申书兴，赵建军，刘立平，石丽娟，王彦华，陈雪平，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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