本发明专利技术涉及生物领域，特别涉及核酸的检测技术，具体为microRNA的测序方法，根据靶位点设计待测microRNA的特异性的扩增引物和待测microRNA的焦磷酸测序引物，所述扩增引物的其中一条引物被生物素标记；提取待测样本的DNA，用设计的所述扩增引物进行PCR扩增反应，得扩增引物，其中，所述特异性扩增引物中的任一条用生物素标记；将所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与所述测序引物进行杂交反应，并分析结果;本发明专利技术所选取的microRNA靶序列，以及应用本发明专利技术的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测microRNA基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于microRNA基因检测预测疾病的发生、发展风险。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物领域，特别涉及核酸的检测技术，具体为microRNA的测序方法，根据靶位点设计待测microRNA的特异性的扩增引物和待测microRNA的焦磷酸测序引物，所述扩增引物的其中一条引物被生物素标记；提取待测样本的DNA，用设计的所述扩增引物进行PCR扩增反应，得扩增引物，其中，所述特异性扩增引物中的任一条用生物素标记；将所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与所述测序引物进行杂交反应，并分析结果;本专利技术所选取的microRNA靶序列，以及应用本专利技术的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测microRNA基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于microRNA基因检测预测疾病的发生、发展风险。【专利说明】microRNA的测序试剂盒及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及适用于二重PCR及二重焦磷酸测序法检测microRNA基因多态性的试剂盒及方法。
技术介绍
microRNA是一类进化高度保守、内源性表达、单链非编码、长约18_25个核苷酸(nucleotide nt)的小 RNA 分子。microRNA 通过与祀分子 mRNA 序列 3’-UTR、5’UTR及开放阅读框互补匹配引起靶分子mRNA降解或翻译抑制，调控着人类功能基因的表达和活性。microRNA是重要的转录后调节因子，在细胞增殖、分化与凋亡、应激抵抗、脂肪代谢等生理过程中发挥重要作用，microRNA表达失衡参与各种疾病的发生发展过程。其基因多态性影响着自身及邻近microRNA表达、二级结构和与靶基因作用能力(RNA2009, 15(9): 1640-1651)，是引起个体及种族间疾病发生发展差异性的原因之一。众多研究表明miCToRNA基因多态性影响着肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病的发生、预后风险。如has-miR-146a rs2910164G — C增加乳腺癌(PLoS0ne2012,7(2):e31615)、肝癌(Carcinogenesis2008, 29 (11):2126-2131)、肺结核(HumImmuno12011, 72(7):598-602)发病风险；has-miR-196a_2rsll614913T — C 缩短肺癌生存时间(J Clin Invest2008, 118(7):2600-2608);has_miR-499rs3746444A —G提高乳腺癌发病率(Hum Mutat2009, 30(1):79-84) ；has-miR-608rs4919510G — C 增加结直肠癌(CancerEpidemiol Biomarkers Prev2012, 21 (1): 217-227; PLoS 0ne2012, 7 (5): e36306)、肾癌(Carcinogenesis2010, 31(10): 1805-1812)、鼻咽癌(Cancer Res2013)预后及乳腺癌(PLoS0ne2012, 7(5):e35252)发 生风险。microRNA基因多态性检测方法包括直接测序法、荧光标记探针法、限制性内切酶法等。焦磷酸测序技术是新一代基于酶级联反应的DNA序列分析技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将DNA单链上的每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术具有其独特的优势，无需电泳、DNA片段无需荧光标记。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量、灵敏度高等特点，符合临床大样本检测要求。目前，还没有基于焦磷酸测序技术的microRNA基因多态性检测方法。本专利技术是基于上述现有技术，并针对现有技术的不足进行改进专利技术的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种microRNA的测序方法，该方法以焦磷酸测序技术为基础，准确度高，操作简便。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为:microRNA的测序方法，所述测序方法为焦磷酸测序法,或结合二重PCR扩增技术，具体包括以下步骤:A特异性引物的设计引物设计根据祀位点设计待测microRNA的特异性的扩增引物和待测microRNA的焦磷酸测序引物，所述扩增引物的其中一条引物被生物素标记；B PCR 反应提取待测样本的DNA，用步骤A涉及的所述扩增引物进行PCR扩增反应，得扩增引物，其中，所述特异性扩增引物中的任一条用生物素标记；C焦磷酸测序将步骤B所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与步骤A所述测序引物进行杂交反应，并分析结果。进一步,所述的microRNA的测序方法,所述祀位点包括has_miR-146ars2910164、has_miR-149rs2293832、 has-miR-196a_2rsll614913、 has_miR-492rs2289030、has_miR-544b rs10934682>has_miR-604rs2368392、has-miR-605rs2043556 和has-miR-608rs4919510位点中的一个或多个。进一步,所述的microRNA的测序方法,在步骤B中，has_miR-146a rs2910164和has-miR-608rs4919510 进行二重 PCR, has-miR-149rs2293832 和 has_miR-605rs2043556进行二重 PCR，has-miR-196a-2rsll614913 和 has-miR-604rs2368392 进行二重PCR, has-miR-492rs2289030 和 has_miR-544b rsl0934682 进行二重 PCR。进一步，所述的microRNA的测序方法，在步骤B中，has_miR-146a rs2910164和 has-miR-608rs4919510 进行二重 PCR 的退火温度为 62 °C ；has-miR-149rs2293832 和has-miR-605rs2043556 进行二重 PCR 的退火温度为 55 °C ;has-miR-196a_2rsl 1614913和 has-miR-604rs2368392 进行二重 PCR 的退火温度为 52 °C ；has-miR-492rs2289030 和has-miR-544b rs 10934682 进行二重 PCR 的退火温度为 58°C。进一步，所述的microRNA的测序方法，在步骤A中，所述扩增引物具体为:has-miR-146a rs2910164位点的特异性引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2 所示；上游引物:5’ accatctctgaaaagccgatgt3’下游引物:bio_5，caagcccacgatgacagagatat3，1?Β8-π?Κ-149ι^2293832位点的特异性引物:其上游引物如SEQ ID Ν0:3所示，下游引物如SEQ ID Ν0:4所示;上游引物:bio_5’gctctggctccgtgtctt3’下游引本文档来自技高网...
【技术保护点】
microRNA的测序方法，其特征在于，所述测序方法为焦磷酸测序法，或结合二重PCR扩增技术，具体包括以下步骤：?A特异性引物的设计引物设计?根据靶位点设计待测microRNA的特异性的扩增引物和待测microRNA的焦磷酸测序引物，所述扩增引物的其中一条引物被生物素标记；?B?PCR反应?提取待测样本的DNA，用步骤A涉及的所述扩增引物进行PCR扩增反应，得扩增引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；?C焦磷酸测序?将步骤B所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与步骤A所述测序引物进行杂交反应，并分析结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张安强，蒋建新，顾玮，曾灵，杨策，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：
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