生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用技术

技术编号:9564639 阅读:124 留言:0更新日期:2014-01-15 19:07
本发明专利技术涉及生物技术领域,公开了生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用,包括以下步骤:a.从类球红细菌菌液中提起总基因组DNA;b.用聚合酶链式反应扩增出UbiG基因;c.将扩增出的UbiG基因与广宿主质粒连接,构建重组载体;d.将重组载体转化至大肠杆菌S17-1中;e.将大肠杆菌S17-1与类球红细菌进行接合转移,即得工程菌。本发明专利技术提供的通过调控类球红细菌芳香环修饰途径提高辅酶Q10产量的方法操作简单,能将辅酶Q10合成能力提高30%以上,适合辅酶Q10大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物
,公开了生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用,包括以下步骤:a.从类球红细菌菌液中提起总基因组DNA;b.用聚合酶链式反应扩增出UbiG基因;c.将扩增出的UbiG基因与广宿主质粒连接,构建重组载体;d.将重组载体转化至大肠杆菌S17-1中;e.将大肠杆菌S17-1与类球红细菌进行接合转移,即得工程菌。本专利技术提供的通过调控类球红细菌芳香环修饰途径提高辅酶Q10产量的方法操作简单,能将辅酶Q10合成能力提高30%以上,适合辅酶Q10大规模工业化生产。【专利说明】生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
本专利技术涉及生物
,尤其涉及了一种生产辅酶QlO工程菌的构建方法、工程菌及其应用。
技术介绍
辅酶Q是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物,不同来源的辅酶Q其侧链异戊烯单位的数目不同,人类和哺乳动物是10个异戊烯单位,故称辅酶Q10。如式(I )所示: 辅酶QlO是生物细胞呼吸链中的重要递氢体,是一种良好的生化药物,近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。此外,在治疗坏血病、卜二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最近,研究者发现CoQlO具有抗衰老作用,从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域,使其在国内外的需求进一步扩大。辅酶QlO的制备方法主要有三种,即动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动植物辅酶QlO含量低,而且各种化学成份复杂,并受原料和来源限制,因此产品成本高,价格昂贵,规模化生产受到了一定限制。化学合成法技术上比较成熟,主要是以来源较丰富的茄尼醇为原料合成的,但其产物为顺反异构体的混合物,生物活性低,合成生物活性高的CoQlO尚未达到工业化生产的程度。微生物发酵法合成的辅酶QlO成本低、无光学异构体,生物学活性高,大规模生产应用效果好。常用的微生物包括红螺菌,土壤杆菌,类球红细菌,根瘤菌等。其中类球红细菌培养简单,是辅酶QlO高效的生产菌之一。在细菌中,辅酶Q由两部分组成:醌环部分和异戊二烯侧链部分。醌环骨架由分支酸途径合成,前体是对羟基苯甲酸。侧链由异戊二烯途径合成,侧链的长短决定了辅酶Q的种类的不同。在类球红细菌中,异戊二烯焦磷酸异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)与9分子异戊二烯焦磷酸(IPP)依次在栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶及聚十异戊二烯焦磷酸合酶的催化下生成聚十异戊二烯焦磷酸。十异戊二烯焦磷酸和对羟基苯甲酸缩合形成辅酶QlO的前体物,该前体物苯环经修饰之后形成目标产物辅酶Q10。辅酶QlO的芳香环修饰反应是辅酶QlO合成的限速步骤。其中UbiG编码的酶催化三次甲基化反应。目前尚无专利是有关于通过UbiG基因过表达强化类球红细菌辅酶QlO的合成能力。
技术实现思路
本专利技术针对微生物发酵法生产辅酶QlO产量较低且生产成本较高等缺点,提供了一种能显著提高辅酶QlO产量的生产辅酶QlO工程菌的构建方法、工程菌及其应用。通过引用该方法,可以极大提高应用微生物发酵法生产辅酶QlO的产量,降低了辅酶QlO的生产成本。为了解决上述技术问题,本专利技术通过下述技术方案得以解决:生产辅酶QlO的工程菌的构建方法,包括以下步骤:a.从类球红细菌菌液中提起总基因组DNA ;b.用聚合酶链式反应扩增出UbiG基因;c.将扩增出的UbiG基因与广宿主质粒连接,构建重组载体;d.将重组载体转化至大肠杆菌S17-1中;e.将携带基因敲除质粒的大肠杆菌S17-1与类球红细菌进行接合转移,即得工程菌。作为优选,所述的UbiG基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。作为优选,所述的广宿主质粒为克隆载体pBBRlMCS-2。一株利用上述构建方法得到的用于生产辅酶QlO的工程菌,该菌为类球红细菌,拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides ;命名为NHU-ZUB菌株;保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏时间:2012年4月13日;保藏编号=CGMCCN0.5997。利用上述的工程菌生产辅酶QlO的方法如下:f.挑取NHU-ZUB菌株单克隆接种于含IOmL种子培养基的50mL摇瓶中,转速为200rpm,在26-34°C培养23h,得一级种子; g.将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中,在26_34°C,200rpm的条件下培养23h,获得二级种子;h.将二级种子以1%的比例接种至含IOOmL发酵培养基的500mL中,在26_34°C,200rpm的条件下培养120h,收集菌液并可通过常规方法提取菌液中的辅酶QlO。作为优选,所述的种子培养基每IOOmL中含有:(NH4)2SO4 0.25g,玉米衆 0.05g,酵母提取物 0.14g, NaCl 0.2g,葡萄糖 0.3g,K2HPO4 0.05g, KH2PO4 0.05g,MgSO4 0.1gjFeSO4 0.01gjCoCl2 0.003g,MnSO4 0.0OOlgjCaCO30.8g,维生素BI 0.1 μ g,维生素K 0.1 μ g,维生素A 0.15 μ g ;ρΗ调节为7.2。作为优选,所述的发酵培养基每IOOmL中含有:(NH4)2SO4 0.3g,NaCl 0.28g,葡萄糖 4g,KH2PO4 0.15g,味精 0.3g,MgSO4 0.63g,玉米浆 0.4g,FeSO4 0.12g,CoCl2 0.005g, CaCO3 0.6g,维生素 BI 0.1 μ g,维生素 K 0.1 μ g,维生素A 0.15 μ g ;ρΗ调节为7.2。其中类球红细菌可从河边污泥中分离得到;大肠杆菌S17-1购自美国模式培养物集存库,编号ATCC47055。本专利技术由于采用了以上技术方案,具有显著的技术效果:本专利技术提供的通过调控类球红细菌芳香环修饰途径提高辅酶QlO产量的方法操作简单,能有效降低生产成本,对仪器设备要求低,生产过程对环境污染小,将该工程菌应用于辅酶QlO的微生物发酵法生产,能够在不改变原有的生产过程,工艺步骤,培养条件的情况下,使微生物发酵法生产辅酶QlO的生产能力在原有基础上提高达30%以上,适合辅酶QlO大规模工业化生产,具有很高的应用价值和工业实用性。保藏信息保藏名称:类球红细菌,拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides ;命名为NHU-ZUB 菌株;保藏时间:2012年4月13日;保藏编号:CGMCCN0.5997 ;保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步详细描述:实施例1一、重组质粒的构建1.设计引物用Primer5引物设计软件设计引物序列。克隆基因UbiG,上游引物:CGGGATCCGCAATGGAATCGTCCAGCACC,下游引物:CCCAAGCTTTCTGAGACGGGACCGGAAG,上游引物添加酶切位点BamHI,下游引物添加酶切位点Hindlll。2.提取类球红细菌基因组(所用试剂均来自Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒)I)吸取0.5-4mL细菌(最多5 X 109个细菌),13500rpm离心I分钟,本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种生产辅酶Q10的工程菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:a.?从类球红细菌菌液中提起总基因组DNA;b.?用聚合酶链式反应扩增出UbiG基因;c.?将扩增出的UbiG基因与广宿主质粒连接,构建重组载体;d.?将重组载体转化至大肠杆菌S17?1中;e.?将大肠杆菌S17?1与类球红细菌进行接合转移,即得工程菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:于洪巍石一军陆文强晏文武石春晓
申请(专利权)人:浙江新和成股份有限公司上虞新和成生物化工有限公司
类型:发明
国别省市:

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