一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法，本发明专利技术的重组大熊猫IL-2免疫佐剂一种效果显著且又提取简便，且能直接应用于生产及临床应用的重组大熊猫IL-2(gpIL-2)免疫佐剂，提高犬瘟热疫苗以及其他常规疫苗的免疫效果，控制疾病的发生与流行，保护大熊猫的健康。犬瘟热素有“毁灭性传染病”之称，已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病，严重影响了大熊猫的健康发展。本发明专利技术重组大熊猫IL-2(gpIL-2)免疫佐剂能显著增强犬瘟热疫苗免疫效果，对犬瘟热的防治具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种重组大熊猫IL?2免疫佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、大熊猫IL?2全基因克隆；A11大熊猫外周血淋巴细胞体外培养；无菌条件下采取健康大熊猫抗凝血2ml，置于EDTA?Na2真空管中，然后往里加入等量D?Hanks液稀释；缓慢加入4ml淋巴细胞分离液于稀释后的大熊猫外周血中，2000r/min离心20min；小心将白细胞移于另一试管，加等量RPMI1640液，2000r/min离心15min，去上清，沉淀物再加入4mlRPMl1640液，洗涤2次，去上清；沉淀淋巴细胞用含10μg/mL?ConA、10％小牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640液悬浮，取10μL细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5×106个/mL，分装于细胞培养瓶中，CO2培养箱中37℃培养24h；A12总RNA提取；A13cDNA的合成；以上步抽提的总RNA为模板，按照Prime?ScriptTM?RT?reagent?kit反转录试剂盒的操作步骤进行反转录；A14引物的设计与合成；根据GenBank中已报道的大熊猫IL?2cDNA序列，运用引物设计软件Oligo6.0设计两对扩增IL?2全基因的引物，具体序列如下表所示：A15目的基因的PCR扩增；以大熊猫基因组cDNA为模板，以IL?2P1/P2为引物进行PCR扩增；反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，58℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环； 72℃延伸10min；于10℃保存；A16目的基因PCR产物的TA克隆；A161目的片段的回收；A162目的片段与克隆载体连接；将上步回收的产物与pMD18?T?Simple?Vector进行连接，16℃连接过夜；A163DH5α感受态细胞的制备；A164连接产物的转化；A17重组质粒的初步鉴定；A2、大熊猫白介素2的原核表达、多克隆抗体的制备；A21引物设计与合成；根据大熊猫IL?2基因测序结果，运用Oligo7.0设计一对引物：IL?2P1/P2；扩增编码IL?2成熟肽的cDNA碱基序列；A22目的片段的PCR扩增；以重组质粒pMD18?T?IL2作为模板，加入合成的特异性引物IL?2P1/P2，进行PCR扩增；反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，60.8℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存；A23目的基因的TA克隆；A231IL?2的TA克隆；A24重组质粒的初步鉴定；A25原核表达载体的构建；A26重组表达菌株的培养及表达；A27原核表达条件的优化；A28重组表达蛋白的可溶性检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李德生，朱玲，张和民，王承东，易悦，刘骁，
申请(专利权)人：四川卧龙国家级自然保护区管理局，四川农业大学，
类型：发明
国别省市：