本发明专利技术涉及蛋白酶，具体地涉及与源自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的蛋白酶同源的热稳定的蛋白酶，和其由野生型在重组宿主细胞中的制备，所述重组宿主细胞包括转基因植物和非人的转基因动物。所述蛋白酶在动物饲料，尤其是鱼饲料和洗涤剂中是有效的。所述蛋白酶能够降解大豆Bowman-Birk抑制物，和其他抗营养因子，诸如大豆凝集素和Kunitz胰蛋白酶抑制物，以及分离的大豆贮存蛋白大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)。公开了与肽酶家族S2A或S1E的这些蛋白酶的热稳定性相关的特征的结构特点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及蛋白酶，具体地涉及与源自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的蛋白酶同源的热稳定的蛋白酶，和其由野生型在重组宿主细胞中的制备，所述重组宿主细胞包括转基因植物和非人的转基因动物。所述蛋白酶在动物饲料，尤其是鱼饲料和洗涤剂中是有效的。所述蛋白酶能够降解大豆Bowman-Birk抑制物，和其他抗营养因子，诸如大豆凝集素和Kunitz胰蛋白酶抑制物，以及分离的大豆贮存蛋白大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)。公开了与肽酶家族S2A或S1E的这些蛋白酶的热稳定性相关的特征的结构特点。【专利说明】蛋白酶本专利技术申请是基于申请日为2004年6月21日，申请号为“20048001714L 9”(国际申请号为“PCT/DK2004/000432” )，名称为“蛋白酶”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及分离的多肽,其具有蛋白酶活性并与拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)蛋白酶同源，以及编码所述多肽的分离的核酸序列。本专利技术进一步涉及含有这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，所述宿主细胞包括转基因的植物和非-人动物，以及制备和具体在动物饲料，例如鱼饲料方面应用所述蛋白酶的方法。本专利技术的蛋白酶是热稳定性的，并公开了与肽酶家族S2A或SlE的蛋白酶的热稳定性相关的特征的结构特点。本专利技术的蛋白酶进一步有效地降解大豆Bowman-Birk抑制物，以及其他抗营养因子(ant1-nutritional factor)，诸如大豆凝集素(soybean agglutinin)和 Kunitz 膜蛋白酶(trypsin)抑制物，以及分离的大豆忙存蛋白(soy storage protein),如大豆球蛋白(glycinin)和 β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)。
技术介绍
来自拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsis sp.)NRRL18262和达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei) NRRL18133 的蛋白酶在 W088/03947 中公开。源自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶的DNA序列和氨基酸序列显示在DK applicationn0.199600013中。W001/58276公开了酸-稳定性的蛋白酶在动物饲料中的用途，所述酸-稳定性的蛋白酶与源自拟诺卡氏`菌属菌种NRRL18262的蛋白酶，以及源自Nocardiopsis alba DSM14010的蛋白酶相关。然而,这些蛋白酶不是热稳定性的。JP2-255081-A公开了源自拟诺卡氏菌属菌种菌株0PC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，然而却没有序列信息。该菌株已不能得到，因为此保藏物已经撤消。DD20043218公开了源自达松维尔拟诺卡氏菌菌株ZMET43647的蛋白水解的制剂，然而却没有序列信息。看来该菌株已不能得到。在本专利技术的首次申请日之后出版的JP2003284571-A公开了源自拟诺卡氏菌属菌种T0A-1(FERM P-18676)的蛋白酶的氨基酸序列和相应的DNA序列，该序列已经以n0.ADF43564 进入 GENESEQP。在已有技术中描述了热稳定性蛋白酶，例如Lao和Wilson在Appl.Environ.Microbiol.62:4256-4259 (1996)中描述的来自 Thermomonospora fusca YX 的蛋白酶，而且它的序列已经作为sptrembl_086984提交到公共数据库中。然而,此蛋白酶与拟诺卡氏菌属蛋白酶不同源，因为其与本专利技术的蛋白酶的同一性百分数低于60%。本专利技术的一个目的是提供热稳定性的蛋白酶，其与拟诺卡氏菌属蛋白酶同源，尤其是有潜力应用于动物饲料和/或洗涤剂。
技术实现思路
分离并鉴定了若干热稳定性的蛋白酶，即源自达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei)DSM43235 的蛋白酶(见SEQ ID NOs:1和2)、合成的Protease22 (见SEQ ID N0s:7和8)、源自拟诺卡氏菌属菌种DSM16424的蛋白酶 (见 SEQ ID N0s:9 和 10)和源自 Nocardiopsis alba DSM15647 的 Protease8 (见SEQ ID NOs:11 和 12)。在第一个方面，本专利技术涉及分离的多肽，其具有蛋白酶活性并具有至少78°C的解链温度(Tm)，如通过差示扫描量热法(DSC)在IOmM磷酸钠、50mM氯化钠缓冲液中，pH7.0，应用1.5°C/分钟的恒定扫描速率进行测定，其中所述多肽选自:(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与 SEQ ID NO:2 的 1-188、SEQ ID NO:8 的 1-196、SEQ ID NO: 10 的 1-189和/或SEQ ID NO: 12的1-188的氨基酸具有至少60%的同一性程度；(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在低严谨条件下，与SEQ ID NO:1的499-1062、SEQ ID NO: 7的577-1164、SEQ ID NO:9 的 586-1152 和 / 或 SEQ ID NO: 11 的 502-1065 的核苷酸杂交；和(c)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQ ID NO:1的499-1062、SEQ ID N0:7的577-1164,SEQ ID NO:9 的 586-1152 和 / 或 SEQ ID NO: 11 的 502-1065 的核苷酸中的任一个具有至少60%的同一性程度。本专利技术还涉及编码所述蛋白酶的分离的核酸序列；核酸构建体、载体和包含所述核酸序列的宿主细胞；以及制备和具体在动物饲料方面应用所述蛋白酶的方法。在第二个方面,本专利技术涉及:A.肽酶家族S2A和/或肽酶家族SlE的分离的多肽,其具有蛋白酶活性并具有氨基酸序列，所述氨基酸序列在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸:10Y、24S、38T、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、92S、96A、99A、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、135N、147F、151S、165S、166V、171Y、179I 和 / 或 1861 ;优选 10Y、38T、82S、99A、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、165S 和 / 或 171Y ;更优选与 95P、100V 和 / 或 1141中的至少一个一起；和/或与(H35+D61+S143) —起；其中每个位点对应于SEQ ID NO:2的位点；B.B的多肽，其在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸:38T、92S、120T、125Q、131L、135N、147F、151S、165S 和 / 或 171Y ；C.A的多肽，其在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸:10Y、24S、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、96A、99A、118N、122R、129Y、130S、166V、179I 和 /或 186本文档来自技高网...
【技术保护点】
分离的多肽，其具有蛋白酶活性并具有至少78℃的解链温度(Tm)，如通过差示扫描量热法(DSC)在10mM磷酸钠、50mM氯化钠缓冲液中，pH?7.0，应用1.5℃/分钟的恒定扫描速率进行测定，其中所述多肽选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ?ID?NO:2的1?188、SEQ?ID?NO:8的1?196、SEQ?ID?NO:10的1?189和/或SEQ?ID?NO:12的1?188的氨基酸具有至少60%的同一性程度；(b)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在低严谨条件下，与SEQ?ID?NO:1的499?1062、SEQ?ID?NO:7的577?1164、SEQ?ID?NO:9的586?1152和/或SEQ?ID?NO:11的502?1065的核苷酸杂交；(c)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQ?ID?NO:1的499?1062、SEQ?ID?NO:7的577?1164、SEQ?ID?NO:9的586?1152和/或SEQ?ID?NO:11的502?1065的核苷酸中的任一个具有至少60%的同一性程度；(d)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ?ID?NOs:2、8、10或12中任一个的成熟肽的同一性程度为至少大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。(e)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ?ID?NO:2的氨基酸1至188或者SEQ?ID?NO:8的氨基酸1至196的的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；和/或(f)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有SEQ?ID?NO:2的氨基酸1至188，SEQ?ID?NO:8的氨基酸1至196，SEQ?ID?NO:10的氨基酸1至189和/或SEQ?ID?NO:12的氨基酸1至188的氨基酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸。...
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：索伦F拉森，卡斯滕肖霍姆，彼得R奥斯特加德，卡斯藤安德森，莫滕费希尔，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：
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