一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。本发明专利技术的二联重组蛋白包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO1所示。本发明专利技术将嗜水气单胞菌的II形孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比单种外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；本发明专利技术的二联重组蛋白仅需对鱼体进行一次注射，即可获得对多种病原菌的免疫效果，减少了对鱼体的伤害，简化了免疫步骤；本发明专利技术的二联重组蛋白的制备方法适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。本专利技术的二联重组蛋白包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO1所示。本专利技术将嗜水气单胞菌的II形孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比单种外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；本专利技术的二联重组蛋白仅需对鱼体进行一次注射，即可获得对多种病原菌的免疫效果，减少了对鱼体的伤害，简化了免疫步骤；本专利技术的二联重组蛋白的制备方法适合工业化生产。【专利说明】
本专利技术属于生物
，具体涉及一两种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。
技术介绍
近20年来，我国淡水养殖鱼类出现暴发性败血症，给养殖业带来了不可估量的经济损失，研究表明该病的主要病原菌为嗜水气单胞菌和迟顿迟钝爱德华氏菌。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟纯爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是獲鲡的重要病原菌，在春夏交替时节能引起鳗鲡出血性败血症、肝肾肿大、烂鳃病、烂尾病等传染性很强的疾病，人工养殖的美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡和日本鳗鲡均可发生。水产养殖业长期使用化学药物治疗该病，由于产生耐药性等原因，致使可用的安全药物越来越少。最近可见有关嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌全菌灭活苗和亚单位疫苗相关的研究，但要应用这些研究成果对鳗鲡进行免疫以预防多种病原菌的侵害，需要对鳗鲡进行多次注射操作，对鱼体伤害较大，且操作繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可作为疫苗使用的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。本专利技术的另一目的在于提供该二联重组蛋白的制备方法。本专利技术的一技术方案是:一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列分别如SEQ ID NOl的第271~544位和第1~257位所示 。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过一段连接肽连接在一起，该连接肽的序列如SEQ ID NOl的第258~270为所示。本专利技术的另一技术方案是:一种编码所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分的编码核苷酸序列和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的编码核苷酸序列，上述编码核苷酸序列分别如SEQ ID N02的第83广1612位和第f 771位所示。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分的基因序列和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的基因序列通过一段如SEQ ID N02的第772~810位所示的编码一段连接肽的核苷酸序列连接起来。本专利技术的再一技术方案是:一种表达所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的质粒，包括负载有SEQ ID N02所示核苷酸序列的原核表达载体。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。本专利技术的再一技术方案是:一种表达所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的大肠杆菌，该大肠杆菌转化有负载SEQ ID N02所不核苷酸序列的原核表达载体。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为pGEX-2T_His或PGEX-4T-2。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述用于表达的大肠杆菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌DH5 α。本专利技术的再一技术方案是:一种上述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的制备方法，包括如下步骤:(I)分别扩增编码嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的基因序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NOl的第271~544位和第I~257位所示，其核苷酸序列分别如SEQ ID N02的第831~1612位和第1~771位所示；(2)将步骤(1)所得的两个基因序列连接在一起，得到融合基因序列；(3)将步骤(2)所得的融合基因序列连接到原核表达载体中，构建重组表达载体；(4)将步骤(3)中所构建的重组表达载体转化到原核宿主细胞中，并在适于表达所述融合基因的条件下培养被转化的原核宿主细胞；(5)回收并纯化所培养的原核宿主细胞表达的融合蛋白；(6)对步骤(5)所得的融合蛋白进行复性。本专利技术的有益效果是:1、本专利技术将嗜水气单胞菌的II形孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比单种外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；2、本专利技术的二联重组蛋白仅需对鱼体进行一次注射，即可获得对多种病原菌的免疫效果，减少了对鱼体的伤害，简化了免疫步骤；3、本专利技术的二联重组蛋白的制备方法适合工业化生产。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术实施例2的实验结果图之一；图2为本专利技术实施例2的实验结果图之二；图3为本专利技术实施例3的实验结果图；图4为本专利技术实施例4的实验结果图之一；图5为本专利技术实施例4的实验结果图之二；图6为本专利技术实施例4的实验结果图之三；图7为本专利技术实施例4的实验结果图之四。【具体实施方式】以下通过【具体实施方式】结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1本实施例进行本专利技术的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。(OMP-Arom-Edwa)的制备(I)用下列特异性引物扩增嗜水气单胞菌的II型孔蛋白的膜外部分的核苷酸序列:正向引物BllF:5，tcgggcggtggcggctcgggtggcggatcatccggtatcgccaagactgaatg3， (SEQ ID N03)和反向引物 BllR:5，CCGGAATTCctggatcttgtactcggtgtaggc3，(SEQ ID N04)，其中 BllF包括接头区(tcgggcggtggcggctcgggtggcggatca), BllR包括EcoR I酶切位点和保护碱基(CCGGAATTC);用下列特异性引物扩增迟钝爱德华氏菌的ompS2膜外部分的核苷酸序列:正向引物B79F:CGCGGATCCgccggcctgaagtatggcaa (SEQ ID NO5)和反向引物 B79R:acccgagccaccaccgcccgagcctataagcacgggtgaagtcattctcatc (SEQ ID N06)其中 B79F 包括 BamH I 酶切位点和保护性碱基(CGCGGATCC), B79R 包括接头区(acccgagccaccaccgcccgagcctata)。上述引物B79R和BllF的接头区编码的氨基酸序列为SGGGGSGGGS，精氨酸(S)与甘氨酸(G)的特点是柔韧性好、不易断裂，两个基因片段连接后，表达产物的柔韧性好，易曝露两个外膜蛋白的抗原决定簇，使表达产物分别保持两个外膜蛋白的免疫原性。(请将该段与所提供的序列表相比对)上述核苷酸序列的扩增 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，其特征在于：包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列分别如SEQ?ID?NO1的第271~544位和第1~257位所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭松林，关瑞章，王玉，冯建军，林鹏，黄文树，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：