鱼精蛋白的纯化工艺制造技术

本发明专利技术涉及制药领域，特别是涉及蛋白的纯化领域，更为具体的说涉及鱼精蛋白的纯化工艺。为了解决现有技术中鱼精蛋白纯度低的问题。本发明专利技术通过反向硅胶填料的层析分离方式，通过洗脱液中水相和有机相的比例调节，一步层析就可以除去鱼精蛋白中的非功能性杂质蛋白。不仅提高了产品的质量，达到国际水平，符合美国药典（USP）、英国药典(BP)的相关规定，而且提高了产品的安全性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及制药领域，特别是涉及蛋白的纯化领域，更为具体的说涉及鱼精蛋白的纯化工艺。为了解决现有技术中鱼精蛋白纯度低的问题。本专利技术通过反向硅胶填料的层析分离方式，通过洗脱液中水相和有机相的比例调节，一步层析就可以除去鱼精蛋白中的非功能性杂质蛋白。不仅提高了产品的质量，达到国际水平，符合美国药典（USP）、英国药典(BP)的相关规定，而且提高了产品的安全性。【专利说明】鱼精蛋白的纯化工艺
本专利技术涉及制药领域，特别是涉及蛋白的纯化领域，更为具体的说涉及鱼精蛋白的纯化工艺。
技术介绍
鱼精蛋白是一种在鱼类精核中发现的多聚阳离子抗菌短肽，是一种小而简单的球形碱性蛋白，其分子量小，通常在一万以下，一般由30个左右的氨基酸组成，分子富含脯氨酸和精氨酸，其中2 / 3以上是精氨酸，等电点为10~12，可溶于水和稀酸，加热不凝固。按其氨基酸的组成，这些鱼精蛋白大致分为以下三类:(I)单鱼精蛋白(Monoprotamine):碱性氨基酸只有精氨酸一种，这一类有鲱精蛋白，鲭鱼的鲭精蛋白，虹鳟鱼的精蛋白，大麻哈鱼的鲑精蛋白等；(2)双鱼精蛋白(Diprotamine):碱性氨基酸含有精氨酸和组氨酸与赖氨酸的一种，这一类有鲤鱼的鲤精蛋白；(3)三精蛋白:此类鱼精蛋白含有全部3种碱性氨基酸，如鋳精蛋白。目前国产的硫酸鱼精蛋白含非功能性杂蛋白较多，1%硫酸鱼精蛋白溶液的紫外吸收值在260nm~280nm的范围内高达3.0以上，而美国药典(USP)、英国药典(BP)规定，鱼精蛋白在260nm~280nm的范围内的紫外吸收值均不能超过0.1。因此，如何对鱼精蛋白进行纯化，特别是如何能够减少纯化过程中使用溶剂在产品中的残留，成为目如鱼精蛋白纯化中亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种适合于规模生产的鱼精蛋白纯化工艺，主要解决现有技术中鱼精蛋白纯度低的问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术公开了一种鱼精蛋白的纯化工艺包括以下步骤:a.将鱼精蛋白溶解于ρΗ4.0-5.0的缓冲溶液中，过滤，取清液，得到鱼精蛋白样品； b.选择反向柱； c.将鱼精蛋白上样，并用ρΗ4.0-5.0的缓冲溶液平衡反相层析柱； d.分阶段洗脱:A相，ρΗ4.0-5.0的缓冲溶液， B相，ρΗ4.0-5.0的有机缓冲溶液，所述B相中有机溶剂浓度为10-20% (体积百分比)，所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇， 第一阶段，洗脱液B为15%~20%，等度洗脱，收集洗脱液I， 第二阶段，洗脱液B为25%~35%，等度洗脱，收集洗脱液II， 第三阶段，洗脱液B为100%，等度洗脱，收集洗脱液III ；e.取洗脱液II，加入稀硫酸，再加入95%乙醇溶液，过滤，取沉淀； f.收集步骤e中沉淀，干燥，得鱼精蛋白纯化产品。本专利技术通过反向硅胶柱的层析方式，通过洗脱液中水相和有机相的比例调节，一步层析就可以除去鱼精蛋白中的非功能性杂质蛋白。上述方案中，由于三个阶段的洗脱产品不同，且互不影响，即三个阶段的洗脱液比例可以独立选择，而不受其他洗脱阶段中洗脱液的约束。作为上述技术方案的改进，本专利技术进一步公开了所述ρΗ4.0-5.0的缓冲溶液体系为醋酸铵-醋酸缓冲溶液体系。这是因为对于本专利技术中的纯化物而言，醋酸铵-醋酸缓冲体系更容易在后期的沉淀中伴随产品的精制而除去，从而既避免了溶剂残留，又不需要增添额外的除溶剂步骤，简化了工艺。作为另一种改进，所述步骤e中，乙醇加入量为洗脱液II的2飞倍(体积比)。同时，本专利技术还公开了所述反向填料为C4、C8、C18。作为一种更为优选的纯化方式，所述反相柱与紫外检测仪联用。与紫外检测仪联用后，可以实现在线连续监测，从而提高收集效率，进而提供生产效率。作为更进一步的改进，在220nm、254nm以及280nm处检测流出样品，在d步骤中，收集不含杂质的洗脱液。也就是说通过紫外检测仪，收集在254nm处和280nm处吸收值低的洗脱液。最后，本专利技术还公开了所述步骤b中，反向填料与鱼精蛋白的比例不低于1L:(12~20)g。本专利技术公开的反向填料与鱼精蛋白的比例是经过综合考虑分离效果与纯化成本投入两个关系后，得到的优化比例。综上所述，采用本专利技术所公开的鱼精蛋白的纯化工艺，将鱼精蛋白原料中含量较高的非功能性蛋白杂质去除，且对产品的生物效价无不良影响。解决了国产硫酸鱼精蛋白纯度低的问题。不仅提高了产品的质量，达到国际水平，符合美国药典(USP)、英国药典(BP)的相关规定，而且提高了产品的安全性，增强了产品的竞争力。【具体实施方式】在本专利技术中，除非有特殊说明，否则所使用试剂均为市售试剂。本专利技术中所用的鱼精蛋白为市售鱼精蛋白。本专利技术中用于紫外数据检测的仪器为=Monitor UV-900。醋酸铵-醋酸缓冲液配制方法:称取0.05mor0.1mol的醋酸铵，充分溶解于IL水中，加入醋酸，制得PH4.0-5.0的醋酸铵-醋酸缓冲液。实施例1 一种鱼精蛋白的纯化工艺包括以下步骤:a.将鱼精蛋白溶解于ρΗ4.0-5.0的缓冲溶液中，过滤，取清液，得到鱼精蛋白样品； b.选择反向柱； c.将鱼精蛋白上样，并用ρΗ4.0-5.0的缓冲溶液平衡反相层析住；d.分阶段洗脱:A相，ρΗ4.0-5.0的缓冲溶液， B相，ρΗ4.0-5.0的有机缓冲溶液，所述B相中有机溶剂浓度为10-20% (体积百分比)，所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇， 第一阶段，洗脱液B为15%~20%，等度洗脱，收集洗脱液I， 第二阶段，洗脱液B为25%~35%，等度洗脱，收集洗脱液II， 第三阶段，洗脱液B为100%，等度洗脱，收集洗脱液III ； e.取洗脱液II，加入稀硫酸，再加入95%乙醇溶液，过滤，取沉淀； f.收集步骤e中沉淀，干燥，得鱼精蛋白纯化产品。实施例2 在实施例1的基础上，ρΗ4.0-5.0的缓冲溶液体系为醋酸铵-醋酸缓冲溶液体系。实施例3 在以上实施例的基础上，所述步骤e中，乙醇加入量为洗脱液II的2飞倍(体积比)。实施例4 在以上实施例的基础上，所述反向填料为C4、C8、C18。实施例5 在以上实施例的基础上，反相柱 与紫外检测仪联用。譬如，使用制备液相色谱仪与紫外检测仪联用，将自动收集到的洗脱液在线进行检测，从而确定最终的收集瓶数。实施例6 当采用紫外检测仪时，优选的方式是通过220nm、254nm以及280nm检测流出样品,在d步骤中，收集不含杂质的洗脱液。也就是说通过紫外检测仪，收集在254nm处和280nm处吸收值低的洗脱液。实施例7 在以上实施例的基础上，所述步骤b中，反向填料与鱼精蛋白的比例不低于1L:12~20g。实施例8 1、取市售硫酸鱼精蛋白28g溶解在0.07mol/L的醋酸铵-醋酸缓冲溶液中，此时缓冲液pH为4.2，溶解后鱼精蛋白浓度为3%，过滤，取清液，完成鱼精蛋白的预处理。2、将鱼精蛋白清液上样到FinelinelOO柱，填料为C8，上样流速为80ml/min，上样后，用pH为4.2的醋酸铵-醋酸缓冲溶液平衡15min。3、开启紫外检测系统，全波长监测。分阶段洗脱，A相，pH4.2的醋酸铵-醋酸缓冲溶液， B相，pH4.3的乙醇缓冲溶液，乙醇浓度为13% (体积百分比)， 本文档来自技高网...

【技术保护点】
鱼精蛋白的纯化工艺，其特征是包括以下步骤：a．将鱼精蛋白溶解于pH4.0~5.0的缓冲溶液中，过滤，取清液，得到鱼精蛋白样品；b．选择反向柱；c．将鱼精蛋白上样，并用pH4.0~5.0的缓冲溶液平衡反相层析柱；d．分阶段洗脱：A相，pH4.0~5.0的缓冲溶液，B相，pH4.0~5.0的有机缓冲溶液，所述B相中有机溶剂浓度为10~20%（体积百分比），所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇，第一阶段，洗脱液B为15%~20%，等度洗脱，收集洗脱液Ⅰ，第二阶段，洗脱液B为25%~35%，等度洗脱，收集洗脱液Ⅱ，第三阶段，洗脱液B为100%，等度洗脱，收集洗脱液Ⅲ；e．取洗脱液Ⅱ，加入稀硫酸，再加入95%乙醇溶液，过滤，取沉淀；f．收集步骤e中沉淀，干燥，得鱼精蛋白纯化产品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆海波，王冉，李正想，曹云婷，花琼琼，
申请(专利权)人：徐州万邦金桥制药有限公司，上海复星医药产业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：