一种以手工二次离心法制备富血小板血浆的方法技术

本发明专利技术属于富血小板血浆制备技术领域，具体公开了一种以手工二次离心法制备富血小板血浆（PRP）的方法。所述方法采用二次离心，第一次将混有抗凝剂的全血25ml以800g的离心力离心6分钟，吸取分层后全血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中；然后进行第二次离心，即以1400g的离心力离心5分钟，吸取分层后的中间层血浆，约4ml，即得富血小板血浆。采用本技术发明专利技术制备得到的PRP中血小板浓度为886.33×109/L，血红蛋白量为27.72g/L，足够满足临床治疗需要。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于富血小板血浆制备
，具体公开了一种以手工二次离心法制备富血小板血浆（PRP）的方法。所述方法采用二次离心，第一次将混有抗凝剂的全血25ml以800g的离心力离心6分钟，吸取分层后全血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中；然后进行第二次离心，即以1400g的离心力离心5分钟，吸取分层后的中间层血浆，约4ml，即得富血小板血浆。采用本技术专利技术制备得到的PRP中血小板浓度为886.33×109/L，血红蛋白量为27.72g/L，足够满足临床治疗需要。【专利说明】
本专利技术涉及富血小板血浆的制备方法，具体地，涉及。
技术介绍
富血小板血衆(platelet-rich plasma, PRP)是来源于人体的富集血小板细胞的血浆制品，其血小板细胞浓度标准最初由美国迈阿密大学Marx教授于2001年提出，他认为PRP中血小板浓度应为全血中血小板浓度的5倍以上。但大多研究者制备的PRP很难达到这个标准，而且他们在研究中发现，即使PRP中血小板浓度稍低于这个标准仍然能获得良好的治疗效果。在2011年加拿大学者Drew ff.T.提出一个新的标准——PRP中的血小板浓度为全血中血小板浓度的3至5倍，这个标准得到大多数人的认可。PRP的概念最早于1954年由Kingsley CS在《自然》杂志中提出，而PRP最初被分离制备得到并用于临床是在1977年，当时成功用于心外科手术患者，避免了体外循环期间血小板功能的损伤和术后出血。在1982年，DAVID R.KNIGHTON等人将从兔子自身静脉血分离得到的PRP注入其角膜，发现血小板能促进血管增生、胶原合成，从而使角膜混浊、增厚，结果提示血小板能促进组织增生。自此人们便致力于将PRP应用于临床，期望能解决组织、器官损伤后修复的难题。但由于当时PRP的制作工艺不完善，难以得到符合标准的PRP，因此限制了其临床研究。经过将近10年的探索，到了 90年代，才制作出成分较为单一的PRP。从此，PRP在临床中逐渐推广与应用。经过几十年的研究，已探索出几种较为合适的PRP制备方法:手工法(一次离心法、二次离心法和三次离心法)及设备制备法。已经有文献报道并被广泛认可的一次离心法有Anitua法，在1999年，西班牙Eduardo Anitua博士专利技术了此法,他当时采集患者10至20mL静脉血,加入5mL的离心管内，以160g离心力离心6分钟，然后弃取上层(贫血小板血浆层)1ml，再吸取剩余上层血浆至下层(红细胞层)I?2mm,这样5mL的静脉血大约可以获取1.2mL的PRP,遗憾的是,他当时并未对所获得的PRP进行成分分析，从而无从得知PRP中的血红蛋白量。而二次离心法公开发表并被广泛用于研究的方法为Landesberg法。当时Landesberg博士等研究采集3个健康志愿者的静脉血,经以下多种方法离心:第一次离心以IOOg和200g离心力进行离心2分钟至20分钟，然后吸取血浆层(上层和中层)移至另外一个离心管中，进行第二次离心；第二次离心的离心力为100g、200g、250g及400g，时间为2分钟至10分钟，然后吸取弃去上层血浆，剩余的下层血浆即PRP。结果分析得到:第一次离心得到的上中层血小板浓度为全血的229%是最高的浓度，此时的离心方法为以IOOg离心力离心10分钟；进行第二次离心时，少于5分钟的离心时间得到的结果与全血中血小板浓度相比没有意义，但时间增加至10分钟时，200g及250g的离心力均能使得到的结果明显高于全血中血小板浓度，且得到最高浓度血小板的离心力为200g，而以400g离心力进行离心时则出现血小板膜的破坏。因此，制备出含有最高浓度血小板的PRP的二次离心方法为采用200g离心力进行离心10分钟,此即Landesberg法。大多研究都表明:以二次离心法比一次离心法制备的PRP中血小板浓度要高，而在已有文献报道的二次离心法中，有研究者将它们进行了比较，结果认为Landesberg法是一种最优的方法，如袁霆、张长青用4种方法(Aniua法(一次离心160gX6min)、Petrungaro法、Landesberg法、Aghaloo法,后三者为2次离心)进行对照研究，比较不同方法制备的PRP中血小板计数，结果显示Anitua法制备的PRP中血小板计数较另外三种方法低，而最高的为 Landesberg 法。目前虽能制备出成分较为单一、浓度达标的PRP，但其制备技术仍未完全成熟。因为从现今几种制备方法的探索过程来看，研究者均是主观地将离心力固定在几种上，如Landesberg法的探索过程，Landesberg博士就将离心力固定在100g、200g、250g及400g这几个上，而未曾对其他离心力进行研究，得出的结论只能是这几种离心力中能制备出血小板浓度最高的离心力。因此，用这种探索方法要想得到很好的离心力与离心时间的组合，必须要有大量的分组作为基础，得出的结论才有更大的说服力。因此，我们有理由怀疑，Landesberg法并非最好的离心方法。另外，利用手工法制备PRP存在着很大的不稳定性，制备的PRP中血小板浓度的高低与操作者关系密切。目前虽有上市的PRP设备，能稳定地制备出符合标准的PRP，但其价格相当昂贵，在临床应用推广方面受到较大限制，尤其在发展中国家。目前，解决PRP制备问题的方法仍值得进一步探究。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有手工法制备PRP质量不稳定以及设备套装制备技术成本高的缺陷的问题，提供一种以手工二次离心法制备PRP的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现: 一种二次离心法制备富血小板血浆的方法，包括如下步骤:首先，将混有抗凝剂的全血进行第一次离心，第一次离心的条件为800g离心6分钟，第一次离心后，吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中进行第二次离心，第二次离心的条件为1400g离心5分钟，第二次离心结束后，吸取分层后的血浆中的中间层，即得PRP。第一次离心的目的是为了弃去全血中的血红蛋白，弃去离心后的下层血浆可达到这个目的。即第一次离心应尽可能使全血中的血红蛋白沉降至最下层，但同时又要保证仅有少量血小板被离心沉降至下层，因此第一次离心最佳的方法应使得下层中的血红蛋白量更多而血小板更少。本专利技术经过创造性的探索发现，以800g离心6分钟是第一次离心的最佳条件。第二次离心的目的是为了将血小板细胞聚集于中间层，然后吸取中层血浆可得到富含血小板细胞的血浆。采用合适的离心时间和离心力，可以将经过第一次离心提取得到的血液成分中的血小板细胞聚集于中间层，而不损伤血小板。本专利技术经过创造性的探索发现，以1400g离心5分钟是第二次离心的最佳条件，可以达到这个目的。优选地，所述抗凝剂为肝素或水蛭素。更优选地，所述抗凝剂为肝素。优选地，所述肝素在全血中的添加量按照肝素与全血的体积比为0.2:10来确定，所述肝素的浓度为12500单位/2mL。优选地，所述富血小板血浆的具体制备方法为:将混有0.5mL浓度为12500单位/2mL肝素的25mL全血以800g的离心力离心6分钟，吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中，然后以1400g的离心力离心5分钟，吸取分层后的血浆中的中间层，约4ml，即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种手工二次离心法制备富血小板血浆的方法，其特征在于，将混有抗凝剂的全血以800g的离心力离心6分钟，吸取分层后静脉血中的上层及分界层血浆，置于另一离心管中，然后以1400g的离心力离心5分钟，吸取分层后的中间层血浆，即得富血小板血浆。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林子洪，郑秋坚，沈梓维，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：