用于γ-分泌酶测定的方法和组合物技术

本发明专利技术提供基于Notch多肽的多肽底物、基于使用这些底物的测定方法和针对鉴定γ-分泌酶活性抑制剂的筛选方法。所述测定方法和筛选方法适用于高通量多孔板测定仪器。在许多实施方案中，底物多肽被标记以易于检测，和/或可结合其本身被标记的特异性配体。一般来说，所述标记促进检测的高特异性以及高灵敏度。这些特征使得利用标记底物的测定方法和筛选方法尤其适用于高通量测定方式。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于Gamma-分泌酶测定的方法和组合物本申请要求2010年9月7日提交的美国临时申请顺序号61/380，587的权益，其通过引用予以结合。专利
本专利技术包括但不限于用于测量伽马-分泌酶(“ Gamma-分泌酶”)活性的组合物和方法及用于鉴定Gamma-分泌酶活性调节剂的测定法。例如，本公开内容描述了新设计的来源于Notch细胞表面受体的底物用于Gamma-分泌酶活性的高灵敏度测定法。此外，本文鉴定的Gamma-分泌酶底物可用于鉴定Gamma-分泌酶活性的调节剂的测定法中。专利技术背景Gamma-分泌酶加工多种底物，包括淀粉状蛋白前体蛋白(APP)和Notch蛋白。Gamma-分泌酶切割APP释放A β肽，这被广泛认为在阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)中起成因作用。Notch信号转导途径是存在大多数多细胞生物中的高度保守的细胞信号转导系统(Artavanis-Tsakonas等，1999, Science 284 (5415): 770-776) 。Notch蛋白家族成员存在于所有后生动物中，哺乳动物具有4个不同的受体，称为NOTCH1、N0TCH2、N0TCH3和N0TCH4。Notch受体是单-通道(single-pass)跨膜受体蛋白质。结合Notch蛋白并启动信号转导的配体与相邻细胞结合。Notch是由大的胞外部分组成的异寡聚体，其在钙依赖性、非共价相互作用中与由短的胞外区、单跨膜通道和小的胞内区组成的Notch蛋白的较小片段缔合(Brou 等，2000，Mol.Cell 5 (2): 207-16)。除了作用于APP以外，Gamma-分泌酶还加工Notch和其它I型膜蛋白。Notch还被多种蛋白酶切割。Notch信号转导受配体结合控制，其暴露出易遭受受体的蛋白酶剪切的负控制区。人Notchl cDNA的GenBank登记号为AF308602.1，而对于相应的多肽基因产物，其为AAG33848.1。人Notchl具有2556个氨基酸残基。在加工Notch1时，首先，近膜切割在S2部位(在残基 Alal710 和 Vall711 之间，参见 van Tetering 等，2009，J.Biol.Chem.,284:31018-31027的补充图SlA)通过ADAM (—种解联蛋白和金属蛋白酶)金属蛋白酶进行，除去胞外域以产生锚定膜的Notch胞外截短片段(NEXT)。(ADAM家族包括含有解联蛋白样结构域和金属蛋白酶样结构域的蛋白质。ADAM参与不同的细胞过程例如发育、细胞间相互作用和蛋白质胞外域)。NEXT随后在S3位点(参见van Tetering等，2009，J.Biol.Chem., 284:31018-31027的补充图SlA)被Gamma-分泌酶切割，产生Notch胞内域(NICD)，其易位到核中，在核中其调节在胚胎发生、血细胞生成和干细胞分化期间参与决定细胞命运的靶基因的表达(Chan等，1998，Cell, 94, 423-426 ;Berezovska等，1999，Brain ResMol Brain Res., 69:273-280 和 Redmond 等，2000，Nat.Neurosc1., 3:30-40)。Gamma-分泌酶是由至少4个亚基组成的膜结合的天冬氨酰基蛋白酶，4个亚基是早老蛋白(PS，或PS1或PS2)、Aph-1、呆蛋白(Nct)和Pen_2。PS被认为是Gamma-分泌酶的催化亚基，并且PS1和PS2的突变已与家族性阿尔茨海默病(FAD)关联(Sherrington等，1995, Nature, 375:754-760 ；Levy Lahad 等，1995，Science, 269:973-977)。虽然这些 FAD突变的确切病理机制未知，但是已提出假设:它们改变Y -分泌酶的特异性，导致A β 42与Aβ 40 妝的比率提高(Borchelt 等，1996, Neuron, 17:1005-1013 ;Duff 等，1996, Nature,383:710-713 和 Bentahir 等，2006, J Neurochem.，96:732-742)。Αβ 42 比 Αβ 40 更易形成不溶性聚集体，以致FAD突变是有害的。此外，FAD突变还降低Y -分泌酶对Notch和E-钙黏着蛋白加工的活性(Song等，1999，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 96:6959-6963 ；Marambaud 等，2002，EMBO J., 21:1948-1956 和 Marambaud 等，2003，Cell,114:635-645)。若干研究表明，PSl的FAD突变影响Notch切割(Bentahir等，2006，JNeurochem., 96:732-742 ;Song等，1999，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 96:6959-6963;Nakajima等，2000，J Neurosci Res., 62:311-317 ;Amtul 等，2002，Neurobiol Dis.,9:269-273 ;Chen 等，2002，2009，J.Biol.Chem., 277:36521-36526)。目前尚不清楚PSl突变对Notchl切割的不同细胞作用是否归因于细胞因素(例如Y-分泌酶复合物的成熟、底物的运输或Y-分泌酶自身的调节)。虽然已报道了使用NlOOFlag底物的无细胞的Notch/Y -分泌酶测定法(Moehlmann等，2002，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 99:8025-8030)，正是基于蛋白质印迹分析的测定法限制了其在Y -分泌酶表征中的应用，因为它是耗费劳力的，具有低通量，而且无法定量。然而，NlOOFlag是否被 Y-分泌酶加工受到质疑(Keller 等，2006，Biochem.,45:5351-5358)。专利技术概述 需要测定PSl突变是否会直接影响Y-分泌酶的催化活性。为了监测对于Notchl切割的Y -分泌酶活性和开发Notch特异性Y -分泌酶抑制剂，需要使用基于Notch蛋白(例如Notchl)的底物的稳固、特异性和灵敏的体外Y-分泌酶测定法。明确需要对Y-分泌酶的轻易蛋白酶解敏感的可靠的基于Notch的底物。需要开发以高灵敏度特异性地测定Notch被Y-分泌酶蛋白酶解的产物的出 现和量的测定法。此外，仍需要开发Y-分泌酶对Notch的实时活性的测定法。此外仍需要可针对其调节PSl对Notch蛋白的活性的能力而筛选候选化合物的有效测定法。本公开内容提供Y-分泌酶催化的Notchl切割的快速简易的体外测定法。检测Y-分泌酶切割的Notchl产物的这种新的体外Y-分泌酶测定法将是用于更好地表征Y-分泌酶和用于鉴定Y-分泌酶对Notch受体家族成员的活性的调节剂的有价值的方法。第一方面，本公开内容提供一种试剂，其特异性地结合在S3位点被Y -分泌酶催化的Notch受体蛋白质切割的产物。在许多实施方案中，该试剂不结合未被Y-分泌酶切割的Notch受体蛋白质。在其它实施方案中，该试剂包括抗体。在进一步的实施方案中，抗体是多克隆抗体。在其它实施方案中，抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.07 US 61/380,5871.一种测定Y-分泌酶的活性的方法，所述方法包括: 提供疑似含有Y-分泌酶活性的组合物； 使所述组合物与Y -分泌酶的多肽底物接触，所述多肽底物包含与可检测标记结合的Notch底物，其中所述Notch底物被Y -分泌酶切割提供可检测标记产物； 使所述可检测标记产物与以下配体接触: 包含第一标签的第一配体，其中所述第一配体特异性地结合可检测标记，和 包含第一标签的第二配体，其中所述第一配体特异性地结合可检测标记产物；和 测定与所述第一配体和与所述第二配体结合的可检测标记产物的存在情况、量或其组口 ο2.权利要求1的方法，其中所述Notch底物包含与SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。3.权利要求1的方法，其中所述接触发生在容器中。4.权利要求3的方法，其中所述方法是在多个容器中进行的高通量测定方法。5.权利要求4的方法，其中每个容器是多孔测定板中的孔，从而提供高通量的测定方法。6.权利要求1的方法，其中所述可检测标记包含生物素。7.权利要求1的方法，其中所述第一配体包含抗生物素蛋白，所述第一标签包含可检测荧光接纳体。8.权利要求7的方法，其中所述第二配体包含特异性地结合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特异性地结合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗体，所述第一抗体与带有荧光供体的第二抗体结合，所述荧光供体激发与所述第一配体结合的荧光接纳体标签。9.一种测定细胞中Y-分泌酶的活性的方法，所述方法包括: 提供疑似带有Y-分泌酶活性的细胞； 使细胞与包含Y -分泌酶的多肽底物的培养基接触，其中所述底物包含与可检测标记结合的Notch底物，其中通过Y -分泌酶切割标记底物提供可检测标记产物；和测定所述可检测标记产物的存在情况。10.权利要求9的方法，其中所述测定包括: 在合适的孵育期后从培养基中分离细胞以提供上清液；和 测定所述上清液的标记产物。11.权利要求10的方法，其中所述测定还包括: 使所述可检测标记产物与以下配体接触: 包含第一标签的第一配体，其中所述第一配体特异性地结合可检测标记，和 包含第二标签的第二配体，其中所述第二配体特异性地结合可检测标记产物；和 测定与所述第一配体和与所述第二配体结合的标记产物的存在情况、量或其组合。12.权利要求9的方法，其中所述培养基还包含去污剂。13.权利要求9的方法，其中所述可检测标记包含生物素。14.权利要求10的方法，其中测定所述可检测标记产物包括测定包含可检测标记产物和可检测探针的可检测复合物。15.权利要求14的方法，其中所述复合物包含含有第一可检测探针的第一特异性结合成员，其中所述第一特异性结合成员特异性地结合所述可检测标记产物以形成二元复合物。16.权利要求15的方法，其中所述第一探针包含钌。17.权利要求9的方法，其中所述Notch底物包含与SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。18.权利要求9的方法，其中所述接触发生在容器中。19.权利要求18的方法，其中所述方法是在多个容器中进行的高通量测定方法。20.权利要求19的方法，其中每个容器是多孔测定板中的孔，从而提供高通量的测定方法。21.权利要求11的方法，其中所述第一配体包含抗生物素蛋白，所述第一标签包含可检测荧光接纳体。22.权利要求21的方法，其中所述第二配体包含特异性地结合被Y-分泌酶切割后的Notch底物而不特异性地结合被Y -分泌酶切割前的Notch底物的第一抗体，所述第一抗体与带有荧光供体的第二抗体结合，所述荧光供体激发与所述第一配体结合的荧光接纳体标签。23.—种筛选Y-分泌酶活性的调节剂的方法，所述方法包括: 提供包含Y-分泌酶活性的组合物； 使所述组合物与包含候选化合`物和Y-分泌酶的多肽底物的混合物接触，其中所述底物包含与可检测标记结合的Notch底物，其中通过Y -分泌酶切割标记底物提供可检测标记产物；和 测定所述候选化合物是否调节所述可检测标记产物的形成。24.权利要求23的方法，其中所述Notch底物包含与SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。25.权利要求23的方法，其中所述接触发生在容器中。26.权利要求25的方法，其中所述方法是在多个容器中进行的高通量测定方法。27....

【专利技术属性】
技术研发人员：李月明，周德明，詹尼弗·钱，克里斯蒂娜·克伦普，
申请(专利权)人：斯隆凯特林纪念癌症中心，
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