重组微生物及其用途制造技术

本发明专利技术尤其提供了用于通过对含CO的底物的微生物发酵产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法、用于这种方法的遗传修饰的微生物、适于制备遗传修饰的微生物的核酸、新的醇脱氢酶和编码所述醇脱氢酶的核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于通过对含一氧化碳的底物的微生物发酵产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法，以及用于这种方法的经遗传修饰的微生物。
技术介绍
已知一些微生物例如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或拜季林斯基氏梭菌(Clostridium bei jerinckii )在丁醇发酵过程中产生丙酮或异丙醇作为主要副产物(ABE 或 IBE 发酵)[George HA, Johnson JL, Moore WEC, Holdeman LV, ChenJS:Acetone, isopropanol, and butanol production by Clostridium beijerinckii (syn.Clostridium butylicum)and Clostridium aurantibutyricum.Appl EnvironMicrobiol45:1160-1163]。但是，所有这些生物均依赖于基于糖或淀粉的底物。产乙酸的生物(例如密切相关的微生物自产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(C.1jungdahlii)和拉氏梭菌(C.ragsdalei))能够以含CO或CO2/H2的气体作为唯一能源和碳源进行化能自养生长，并合成产物例如乙酸、乙醇或2，3- 丁二醇，但是不合成丙酮或异丙酉享[Munasinghe PC, Khanal SK:Biomass-derived syngas fermentation intobiofuels:Opportunities and challenges.Bioresource Technol2010,5013-22]。最近,在IOOL中试规模发酵罐中对拉氏梭菌(梭菌属菌株Pll)的研究中报告了从柳枝稷(switchgrass)衍生的合成气产生了异丙醇[Kundiyana DK, Huhnke RL, WilkinsMR:Syngas fermentation in al00-L pilot scale fermentor:Design and processconsiderations.J Biosci Bioeng2010, 109:492-498]。但是，来自所述同一实验室的相关研究显示，这是由于所使用的 合成气中的污染，因为其通过了含有20%丙酮的洗涤混合物[Ramachandriya KD:Effect of biomass generatedproducer gas, methane and physicalparameters on producer gas fermentations by Clostridium strain Pll.Mastersthesis, Oklahoma State University2009]。作者还注意到,异丙醇的产生可能是由于丙酸(而不是丙酮)还原。由本专利技术的专利技术人用拉氏梭菌(梭菌属菌株PU)和自产醇梭菌以及扬氏梭菌进行的实验从未显示丙酮、异丙醇或丙酸的产生。许多适于产生化学产物(例如丙酮和异丙醇)的碳水化合物原料的成本受到它们作为人类食物或动物饲料的价值的影响，并且种植产淀粉或蔗糖的作物用于这类生产并不是在所有的地域中都是经济上可持续的。因此，需要开发将更低成本的和/或更丰富的碳源转化为有用的化学产物(例如丙酮和异丙醇)的技术。CO是有机材料(例如煤或油和油衍生产品)不完全燃烧的主要的、无成本的、富含能量的副产物。例如，有报道称澳大利亚的钢铁工业每年产生并向大气中排放超过500，000吨CO。本专利技术的目的是克服现有技术的一种或多种缺陷，或者至少为公众提供可用的选择。
技术实现思路
本专利技术广义上提供了，尤其是，用于通过对含CO的底物的微生物发酵产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法、用于这种方法的遗传修饰的微生物、适于制备遗传修饰的微生物的核酸以及新的醇脱氢酶和编码其的核酸。在第一方面，本专利技术提供了一种能够通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物。在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达异丙醇生物合成途径中非天然存于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，所述微生物适于过表达异丙醇生物合成途径中天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达丙酮生物合成途径中天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的酶。在另一个实施方案中，所述微生物适于过表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的酶。在一个实施方案中，所述亲代微生物能够发酵含CO的底物以产生丙酮而不能将丙酮转化为异丙醇，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。在另一个实施方案中，所述亲代微生物能够将丙酮转化为异丙醇而不能够发酵含CO的底物以产生丙酮，所述重组 微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶。在一个实施方案中，所述亲代微生物不能发酵含CO的底物以产生丙酮和异丙醇，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶以及在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。在一个实施方案中，所述异丙醇和/或丙酮生物合成途径中的一种或多种酶选自:乙酰-辅酶A乙酰转移酶(硫解酶；ThlA ；E.C.2.3.1.9)；乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶A (CoA转移酶；CtfA ;EC2.8.3.9);乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶B (CoA转移酶；CtfB ;EC2.8.3.9);乙酰乙酸脱羧酶(Adc；EC4.1.1.4)；α -酮异戊酸脱羧酶(脱羧酶；KivD ；EC4.1.1.74);和，它们中任意一种或多种的功能等价变体。在一个实施方案中，乙酰-辅酶A乙酰转移酶(硫解酶；ThlA)来源自丙酮丁醇梭菌。在一个实施方案中，所述酶乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶A (CoA转移酶；CtfA)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶B (CoA转移酶；CtfB)和乙酰乙酸脱羧酶(Adc)来源自拜季林斯基氏梭菌。在一个实施方案中，所述α -酮异戊酸脱羧酶(脱羧酶；KivD)来源自乳酸乳球菌(Lactococcus IactisX在一个实施方案中，在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶选自:醇脱氢酶(Adh；EC1.1.1.2)；醇脱氢酶(Adh2；EC1.1.1.1)和，其功能等价变体。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶(Adh)来源自自产醇梭菌、扬氏梭菌和/或拉氏梭菌。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ_ID N0.1的氨基酸序列，或者为其功能等价变体。在一个实施方案中，所述功能等价变体与SEQ_ID N0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.25 US 61/446,8321.一种能够通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物。2.权利要求1的微生物，其中所述微生物被改造为适于表达以下一种或多种: a.异丙醇生物合成途径中非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶； b.丙酮生物合成途径中非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。3.权利要求1的微生物，其中所述微生物被改造为适于过表达以下一种或多种: a.异丙醇生物合成途径中天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶； b.丙酮生物合成途径中天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。4.权利要求1-3中任一项的微生物，其中所述微生物适于: a.表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶；和/或 b.过表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。5.权利要求1-4中任一项的微生物，其中所述亲代微生物能够发酵含CO的底物以产生丙酮而不能将丙酮转化为异 丙醇，所述重组微生物被改造为适于表达在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。6.权利要求1-4中任一项的微生物，其中所述亲代微生物能够将丙酮转化为异丙醇而不能够发酵含CO的底物以产生丙酮，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶。7.权利要求1-4中任一项的微生物，其中所述亲代微生物不能发酵含CO的底物以产生丙酮和异丙醇，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶以及在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。8.权利要求1-7中任一项的微生物，其中所述异丙醇和/或丙酮生物合成途径中的一种或多种酶选自: 乙酰-辅酶A乙酰转移酶(硫解酶；ThlA ；E.C.2.3.1.9)； 乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶A (CoA转移酶；CtfA ；EC2.8.3.9)； 乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶B (CoA转移酶；CtfB ；EC2.8.3.9)； 乙酰乙酸脱羧酶(Adc ；EC4.1.1.4)； α -酮异戊酸脱羧酶(脱羧酶；KivD ；EC4.1.1.74);和， 它们中任意一种或多种的功能等价变体。9.权利要求8的微生物，其中所述乙酰-辅酶A乙酰转移酶(硫解酶；ThlA)来源自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutyI icum) ο10.权利要求8的微生物，其中所述酶乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶A(CoA转移酶；CtfA)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶B(CoA转移酶；CtfB)和乙酰乙酸脱羧酶(Adc)来源自拜季林斯基氏梭菌(C.bei jerinckii)。11.权利要求8的微生物，其中所述α-酮异戊酸脱羧酶(脱羧酶；KivD)来源自乳酸乳球菌(Lactococcus IactisX12.权利要求1-11中任一项的微生物，其中所述丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶选自:醇脱氢酶(Adh ；EC1.1.1.2)；醇脱氢酶(Adh2 ；EC1.1.1.1);和， 其功能等价变体。13.权利要求12的微生物，其中所述醇脱氢酶(Adh)来源自自产醇梭菌(C.autoethanogenum)、扬氏梭菌(C.1jungdahlii)和 / 或拉氏梭菌(C.ragsdalei)。14.权利要求12的微生物，其中所述醇脱氢酶(Adh2)来源自酿酒酵母(S.cerevisiae)。15.权利要求13的微生物，其中所述醇脱氢酶具有SEQ_IDN0.1的氨基酸序列，或者其为所述序列的功能等价变体。16.权利要求15的微生物，其中所述功能等价变体与SEQ_IDN0.1具有至少约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。17.权利要求1-16中任一项的微生物,其中所述微生物包含一种或多种外源核酸,所述外源核酸被改造为适于增加所述亲代微生物中天然存在的一种或多种核酸的表达，并且所述亲代微生物中天然存在的一种或多种核酸编码所述丙酮生物合成途径和/或异丙醇生物合成途径中的一种或多种酶。`18.权利要求17的微生物，其中所述被改造为适于增加表达的一种或多种外源核酸为调节元件。19.权利要求1-18中任一项的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码并被改造为适于表达所述丙酮生物合成途径和/或异丙醇生物合成途径中的一种或多种酶。20.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码并被改造为适于表达至少两种所述酶。21.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶(硫解酶；ThlA ；E.C.2.3.1.9)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶A (CoA转移酶；CtfA ；EC2.8.3.9)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶B (CoA转移酶；CtfB ；EC2.8.3.9)和乙酰乙酸脱羧酶(Adc ；EC4.1.1.4)中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。22.权利要求19-21中任一项的微生物，其中所述微生物包含一种或多种编码醇脱氢酶(Adh ；EC1.1.1.2)的外源核酸，或其功能等价变体。23.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码α -酮异戊酸脱羧酶(脱羧酶；KivD ；EC4.1.1.74)和醇脱氢酶(Adh2 ；EC1.1.1.1)中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。24.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶(硫解酶；ThlA ；E.C.2.3.1.9)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶A (CoA转移酶；CtfA ；EC2.8.3.9)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶B (CoA转移酶；CtfB ；EC2.8.3.9)和α -酮异戊酸脱羧酶(脱羧酶；KivD ；EC4.1.1.74)中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。25.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含编码α-酮异戊酸脱羧酶(脱羧酶；KivD ；EC4.1.1.74)的一种或多种外源核酸或其功能等价变体。26.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶(硫解酶；ThlA ；E.C.2.3.1.9)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶A (CoA转移酶；CtfA ；EC2.8.3.9)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶B (CoA转移酶；CtfB ；EC2.8.3.9)、乙酰乙酸脱羧酶(Adc ；EC4.1.1.4)和醇脱氢酶(Adh2 ；EC1.1.1.1)中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。27.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶(硫解酶；ThlA ；E.C.2.3.1.9)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶A (CoA转移酶；CtfA ；EC2.8.3.9)、乙酰乙酰-CoA:乙酸辅酶A转移酶B (CoA转移酶；CtfB ；EC2.8.3.9)、乙酰乙酸脱羧酶(Adc ；EC4.1.1.4)、α -酮异戊酸脱羧酶(脱羧酶；KivD ；EC4.1.1.74)和醇脱氢酶(Adh2 ；EC1.1.1.1)中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。28.权利要求22的微生物，其中所述编码醇脱氢酶(Adh)的核酸包含序列SEQ_IDN0.2、SEQ_ID N0.3或SEQ_ID N0.4，或其任一个的功能等价变体。29.权利要求28的微生物，其中所述编码醇脱氢酶的核酸的功能等价物与SEQ_IDN0.2、3或4具有至少约83%的序列同一性。30.权利要求20-29中任一项的微生物，其中所述外源核酸为具有SEQ_IDN0.46、48、81、82、93、96或99的核苷酸序列的表达质粒。31.权利要求1-30中任一项的微生物`，其中所述亲代微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌，其包含:自产醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)> 幾味梭菌(Clostridium scatologenes)、游泥丁酸杆菌(Butyribacterium limosum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、巴氏嗜喊菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、派泥真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)?32.权利要求31的微生物，其中所述亲代微生物为自产醇梭菌或扬氏梭菌。33.权利要求32的微生物，其中所述微生物为自产醇梭菌DSM23693或扬氏梭菌DSM13528 (或 ATCC55383)。34.权利要求1-33中任一项的微生物，其中所述亲代微生物缺少编码ThlA、CtfA,CtfB, Adc、KivD、Adh2和Adh的一种或多种基因。35.权利要求34的微生物，其中所述亲代微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·D·辛普森，M·科普克，F·刘，W·Y·陈，
申请(专利权)人：新西兰郎泽科技公司，
类型：
国别省市：