本公开涉及在缺乏可用抗原标准品的情况下开发用于量化疫苗组合物中的抗原的改进方法。更具体地说，本公开提供了从疫苗组合物分离抗原的快速和稳健方法，包括在没有去污剂和没有烷基化的情况下溶解抗原、使用酸化防止抗原亚型再次结合、用色谱法离析抗原亚型和用氨基酸分析量化所洗脱的抗原的步骤。本公开的方法适于用于各种抗原，由此在迄今为止疫苗制造的领域中提供改进方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2011年4月21日提交的序列号61/477，835的美国临时专利申请的权益，该临时申请以引用的方式整体并入本文。领域本公开通常涉及疫苗领域及用于在没有已知标准品的情况下离析和测量疫苗中的抗原含量的方法。背景流感病毒基于其核蛋白抗原和基质蛋白抗原之间的抗原性差异通常分为三类:A、B和C。取决于两种主要病毒表面糖蛋白:血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性质，流感病毒进一步分为亚型。HA和NA均携带抗原表位。产生针对HA和NA的抗体与抵抗人类和动物中的感染和/或疾病相关联。针对流感接种疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量来决定。因此，A型和B型流感病毒的主要的抗原决定簇是HA而对流感接种疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量即抗原含量来决定。迄今为止，抗原含量用世界卫生组织合作中心(以下称为“WHO”)提供的国际标准品来测量，其用于测定抗原值例如疫苗的HA含量。然而，通常，当标准品不可用时，例如当病毒抗原的不同季节菌株存在抗原性差异(即较低同源性)或当存在病毒的大流行爆发而对于其尚无可用标准品时，疫苗由疫苗制造商制备。这种大流行病爆发发生在2009年4月，当墨西哥、美国和几个其它国家中A型流感/加利福尼亚/07/2009 HlNl大流行病爆发时，组合来自人类、猪和禽流感的基因的新型流感菌株进化，最初称为“猪流感”。在此特定的情况下，在WHO具有用于Hl抗原的可用标准品之前，需要疫苗。在2009年9月，美国食品和药品管理局批准了针对2009年HlNl流感病毒的四种疫苗。然而在开发这些疫苗的时候，仍然没有可用的WHO标准品来量化新疫苗中的HA。数十年来，已经使用具有由世界卫生组织(WHO)合作中心提供的国际标准品的单向辐射免疫扩散(SRID或SRD)对流感疫苗的HA含量进行了测定。这些国际标准用于测定抗原值例如疫苗的HA含量。在SRID中，流感病毒颗粒被去污剂破坏，并且被呈递使其在载有抗体的琼脂糖凝胶中在室温下免疫扩散三天。在凝胶染色时，测量抗原-抗体复合物的沉淀区域的直径，并且通过使用用具有已知HA含量的这种亚型的整个病毒参考批次获得的校准曲线，计算某亚型的病毒制剂的抗原含量。然而，SRID是费力且低通量的测定法。此外，特别对于未经纯化的(过程中的)流感病毒，灵敏度、准确度和精确度相对较低。Kapteyn等(Vaccine 24:3137-44, 2006 ;“Kapteyn”)公开了用于量化流感病毒培养中的HA以及用于鉴定来自三价疫苗中的单个流感菌株的HA的RP-HPLC测定法。然而，Kapteyn的方法不在没有标准品的情况下量化HA。另外，Kapteyn使用去污剂溶解抗原和烷基化以防止具有活性巯基基团的蛋白质重新结合并形成复合物。实际上，在Kapteyn的方法中，HA通过使用强去污剂溶解膜而被完全离析。Kapteyn的方法也没有被描述适于量化来自福尔马林灭活的流感菌株的HA。因此，迄今为止本领域没有公开用于准确地和有效地测定粗制或纯化HA样品中的HA抗原浓度的方法，特别是在不用去污剂或烷基化试剂处理的样品中以及在缺少由WHO合作中心提供的HA蛋白标准品下。显然，在可从WHO合作中心得到抗原标准品之前，在本领域中非常需要用于在疫苗制造中可靠离析和量化包括病毒抗原诸如HA抗原的抗原的稳健、准确和快速的方法。下面的公开描述了此类方法的详情。概述开发本文描述的方法以在缺乏可用抗原标准品的情况下提供测量疫苗中的抗原含量的装置。因此，本专利技术解决本领域中涉及在不需要国际标准品的情况下、在疫苗开发和制造过程期间快速和准确量化疫苗中的抗原浓度的一个或多个需要。因此，本文提供的方法允许疫苗制造商在不等待WHO开发和提供标准品的情况下更快地生产疫苗，该疫苗可以被传递给公众。更具体地说，本专利技术在不使用标准品的情况下提供离析和准确量化疫苗抗原的快速和稳健方法，其是准确且可重复的。本公开适于用于各种抗原，由此在迄今为止疫苗制造的领域中提供改进方法。本专利技术提供了用于从疫苗组合物离析抗原的方法，该方法包括以下步骤:(a)在没有去污剂和没有烷基化试剂的情况下溶解疫苗组合物中的抗原；和(b)通过分级分离离析抗原或抗原亚型。在一些方面中，溶解步骤通过还原进行。在一些方面中，还原包括用二硫苏糖醇处理疫苗组合物。在一些方面中，还原包括约5分钟至约20小时的孵育时间。在其它方面中，还原包括约30分钟至约2小时的孵育时间。在更具体的方面中，还原包括约I小时的孵育时间。在另外的方面中，还原包括约20°C至约100°C的孵育温度。在各种方面中，还原包括约50°C至约90°C的孵育温度。在某些方面中，还原包括约85°C的孵育温度。在进一步的方面中，还原步骤是受pH控制的。在各种方面中，还原在约pH 6至约pH 11的pH下进行。在特定方面中，还原在约PH 7至约`pH 10的pH下进行。在附加方面中，溶解步骤还包括用离液剂变性。在各种方面中，离液剂是盐酸胍、脲、硫脲、锂、高氯酸盐或硫氰酸盐。在另外的方面中，还原还通过酸化抗原或抗原亚型来进行，以防止在分离的抗原亚型之间形成二硫键。在各种方面中，用磷酸、盐酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸或甲酸进行酸化。在一些方面中，分级分离通过色谱法进行。在各种方面中，色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)、离子交换HPLC (IEX-HPLC)、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)或尺寸排阻色谱法(SEC)。在示例性方面中，色谱法是反相(RP)-HPLC。本专利技术还提供用于量化疫苗组合物中的抗原或抗原亚型含量的方法。此类方法包括上文所述的的用于从疫苗组合物离析抗原的所有方法(具有量化抗原或抗原亚型的另一步骤)。在示例性方面中，量化步骤在不使用抗原标准品的情况下进行。在各种方面中，量化步骤包括通过氨基酸分析量化抗原。在一些方面中，抗原是病毒的或细菌的。在某些方面中，抗原是血凝素(HA)。在特定方面中，HA来自流感病毒疫苗组合物、麻疹病毒疫苗组合物、副流感病毒疫苗组合物或腮腺炎病毒疫苗组合物。在一些方面中，疫苗组合物是流感病毒疫苗组合物。在另外的方面中，流感病毒疫苗组合物提供对选自由A型流感和B型流感组成的组的流感病毒的防护作用。在各种方面中，抗原亚型是A型流感HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15 和 HA16 与 B 型流感 HA 的任一种。在某些方面中，抗原亚型是4型流感撤亚型撤1、撤2、撤3、撤5、撤7、撤9、撤10或B型流感HA。在示例性方面中，A型流感HA亚型是HAl。在另外的方面中，流感疫苗组合物提供对选自由 A 型流感 HlNl、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7和B型流感组成的组的流感类型的防护作用。在各种方面中，该方法量化抗原含量，其相对标准偏差(RSD)小于约2.5%。在更具体的方面中，RSD为约2.2%。在进一步更具体的方面中，RSD为约1.3%ο上述概述并非意图定义本公开的每个方面，并且附加方面在其它部分例如下列详述中有所描述。整个文件旨在作为统一的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.21 US 61/477,8351.一种用于从疫苗组合物离析抗原的方法，所述方法包括以下步骤: (a)在没有去污剂和没有烷基化试剂的情况下溶解所述疫苗组合物中的所述抗原；以及 (b)通过分级分离来离析所述抗原或抗原亚型。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶解步骤通过还原进行。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述还原包括用二硫苏糖醇处理所述疫苗组合物。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述溶解步骤还包括用离液剂变性。5.根据权利要求2-4的任一项所述的方法，其中所述还原还通过酸化所述抗原或抗原亚型来进行，以防止在分离的抗原亚型之间形成二硫键。6.一种用于量化包括抗原的疫苗组合物中的抗原或抗原亚型含量的方法，所述方法包括权利要求1-5的任一项所述的方法以及量化所述抗原或抗原亚型的另一步骤。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述量化步骤在不使用抗原标准品的情况下进行。8.根据权利要求6所述 的方法，其中所述量化步骤使用抗原标准品进行。9.根据权利要求7-8的任一项所述的方法，其中所述量化步骤包括通过氨基酸分析量化抗原。10.根据权利要求3-9的任一项所述的方法，其中所述还原包括约5分钟至约20小时的孵育时间。11.根据权利要求3-10的任一项所述的方法，其中所述还原包括约30分钟至约2小时的孵育时间。12.根据权利要求3-11的任一项所述的方法，其中所述还原包括约I小时的孵育时间。13.根据权利要求3-12的任一项所述的方法，其中所述还原包括约20°C至约100°C的孵育温度。14.根据权利要求3-13的任一项所述的方法，其中所述还原包括约50°C至约90°C的孵育温度。15.根据权利要求3-14的任一项所述的方法，其中所述还原包括约85°C的孵育温度。16.根据权利要求4-15的任一项所述的方法，其中所述离液剂是盐酸胍、脲、硫脲、锂、高氯酸盐或硫氰酸盐。17.根据权利要求4-16的任一项所述的方法，其中所述酸化用磷酸、盐酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸或甲酸进行。18.根据权利要求1-17的任一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔·格兰因戈尔，马丁·卡利沃达，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特医疗保健股份有限公司，
类型：
国别省市：
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