FT4体外诊断试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种FT4体外诊断试剂盒，本发明专利技术对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行FT4的检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种FT4体外诊断试剂盒，本专利技术对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行FT4的检测。【专利说明】FT4体外诊断试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及一种FT4检测试剂盒，具体涉及一种FT4体外诊断试剂盒及其使用方法。
技术介绍
游离甲状腺激素(Free Thyroid Hormone, FT4)评价甲状腺功能和研究下丘脑-垂体-甲状腺轴的主要指标之一。FT4是甲状腺激素的生物活性部分，能直接反映甲状腺功能状态，并且不受血中甲状腺素结合球蛋白(TBG)浓度及结合力改变的影响。甲亢时FT4测定数值显著高于正常范围；甲低时显著低于正常范围。慢性活动性肝炎，原发性肝汁性肝硬化也会引起FT4的下降。妊娠36周以后FT4正常生理性降低。FT4以前一直用放射免疫分析(RIA)，放射免疫分析它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质，但是放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题，用ELISA方法快速简便，既有放射免疫分析的优点，同时也减少了污染。竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和固相抗原竞争结合酶标抗体，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下:(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤。(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗体与固相载体结合的机会，使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。(3)加发光液显色:参考管中由于结合的酶标抗体最多，信号值最高。参考管信号值与待测管信号值的大小，代表受检标本抗原的量。待测管信号值越低，表示标本中抗原含量越多。由于半抗原都是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。通常在市面上比较多的FT4试剂盒有放免试剂盒以及ELISA试剂盒，放免试剂盒存在诸多的地方，包括以下方面: 一，放射性 某些放射性同位素由于半衰期短不利于储存和运输，同时由于放射性物质的污染对工作人员的健康以及环境也造成了一定的危害，需要特殊的防护以及废物处理等设备，大大的增加了成本。二，灵敏度。通常ELISA试剂盒的分析灵敏度可达到10_13mol/L，固相放免试剂盒的分析灵敏度刻达到10_16mOl/L。三，有效期 一般来说，放免只能保存3个月，ELISA试剂盒保存6个月。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种FT4体外诊断试剂盒及其使用方法。本专利技术对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行FT4的检测。本专利技术的一种FT4体外诊断试剂盒及其使用方法技术方案为，该FT4体外诊断试剂盒，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原FT4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的FT4抗原；酶结合物中含有FT4酶标抗体。发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。微孔板中含有的小分子耦联蛋白，是将小分子半抗原FT4耦联载体蛋白BSA得到的小分子耦联蛋白。所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原FT4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白。将小分子半抗原FT4和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为: ①平衡EDC，NHS至室温； ②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解； ③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后再加入1-2体积份的EDC ;再室温反应10-20分钟； ④加入巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白EDC-BSA； ⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原FT4，室温反应1.5-3小时； ⑥加入Tris终止反应，得到耦联蛋白BSA-FT4； ⑦加入脱盐柱，将里面的储存液排出，然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。步骤②中活化缓冲液包括:0.1M的MES，0.5M的NAC1，调节pH为6.0。步骤②中EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL。步骤⑥中Tris 为 20-50 mmol/L。耦联好的蛋白包被方式制备试剂盒，步骤为: ①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时； ②甩干板条，加入封闭液，37度放置2小时； ③洗漆一次后，放入真空干燥箱4-6小时； ④真空封袋后，放入4度冰箱。其中，步骤①中的包被液为，氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的混合水溶液，其中还可以含有防腐剂。上述的FT4体外诊断试剂盒的使用方法，其特征在于， ①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀,37 0C反应50-80分钟；②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL； ③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原FT4的量。浓缩洗涤液加纯水稀释为洗涤液(例:20X浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为IX洗涤液)。本专利技术的有益效果为:本专利技术的试剂盒使用方便，本专利技术运用化学发光法定量检测，可以使其检测范围更加宽广，增加其灵敏度，精密度实验也优于一般的ELISA方法。而对比市面上的化学方法定量检测试剂盒，本专利技术试剂盒用的为间接法，通过包被小分子半抗原，采用竞争法检测FT4。小分子抗原，又称为半抗原，这些小分子本身没有免疫原性，当与载体结合后形成大分子，可以获得免疫原性。半抗原与载体形成的免疫原，当半抗原分子量极小，或则极性较大时，小分子抗原往往不容易直接固相吸附于板条上，使用BSA偶联小分子，可以形成较大的分子量，通过疏水作用就容易吸附于固相载体上，这样的方法灵敏度高，高度的特异性和灵敏性，能使分析过程简化。EDC将FT4和载体进行耦联。EDC能与载体蛋白BSA形成一种活泼的酯结构，半抗原FT4的基团上有羧基基团，能使之与BSA-EDC反应，可以形成BSA-FT4偶联物。采用竞争法检测小分子半抗原FT4，该方法的好处在于操作简单，一步完成，包被一般不会出现过量包被造成IC50值(被抑制一半时抑制剂的浓度)较高，并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应，灵敏度和精确度较高。而采用包被抗体的方法很容易造成包被过量影响IC50值，并且小分子的标记通常不能采用经典的过碘酸钠法，需要采用其他的化学方法，EDC0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种FT4体外诊断试剂盒，其特征在于，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原FT4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的FT4抗原；酶结合物中含有FT4酶标抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：穆海东，汪宁梅，陈福美，沈珏璟，
申请(专利权)人：上海裕隆医学检验所股份有限公司，
类型：发明
国别省市：