本发明专利技术公开了一种检测猪蓝耳病活疫苗JXA1-R株的方法及试剂盒。检测方法是采用RFLP分析法，设计合成扩增JXA1-R株ORF1a3195～3682位核苷酸片段的引物，提取待检样品中的RNA，通过RT-PCR扩增JXA1-R株ORF1a3195～3682位核苷酸片段，扩增产物经限制性核酸内切酶SacⅡ切割后，产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现长度487bp的条带时判断为该待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXA1-R株。所述试剂盒主要包括上述的引物及限制性核酸内切酶SacⅡ。本发明专利技术应用普通PCR和一些常规仪器即可完成检测，步骤简单，缩短了检测时间，也显著降低了检测成本。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测猪蓝耳病活疫苗JXA1-R株的方法及试剂盒。检测方法是采用RFLP分析法，设计合成扩增JXA1-R株ORF1a3195～3682位核苷酸片段的引物，提取待检样品中的RNA，通过RT-PCR扩增JXA1-R株ORF1a3195～3682位核苷酸片段，扩增产物经限制性核酸内切酶SacⅡ切割后，产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现长度487bp的条带时判断为该待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXA1-R株。所述试剂盒主要包括上述的引物及限制性核酸内切酶SacⅡ。本专利技术应用普通PCR和一些常规仪器即可完成检测，步骤简单，缩短了检测时间，也显著降低了检测成本。【专利说明】—种检测猪蓝耳病活疫苗JXA1-R株的方法及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学检测
，具体涉及一种检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法及试剂盒。
技术介绍
高致病性猪蓝耳病是由高致病性的猪蓝耳病毒(又称猪繁殖与呼吸综合征病毒，porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的母猪严重繁殖障碍、断奶猪生长迟缓及死亡的传染性疾病。该病自06年爆发以来，给国内养猪业造成了巨大的经济损失，目前绝大多数猪场使用PRRSV变异株(JXAl-R)弱毒疫苗(即猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株，或简称JXAl-R疫苗株)对该病进行预防。高致病性猪蓝耳病和普通猪蓝耳病可用RT-PCR (逆转录聚合酶链式反应)进行鉴别检测，但JXAl-R疫苗株与野毒株无法用现有的PCR (聚合酶链式反应)方法进行鉴别检测。JXAl-R疫苗株可在猪体内繁殖并产生病毒血症，这给高致病性猪蓝耳病的实验室诊断造成很大干扰，难以确定检测到的高致病性猪蓝耳病毒是疫苗毒还是野毒。当前已有的JXAl-R疫苗株鉴别检测方法有以下两种: 方法一是使用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXAl-R株)实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以荧光定量PCR技术为基础，在荧光定量PCR仪上进行反应，当有特定的扩增曲线时，则判定为高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒(JXAl-R疫苗株)阳性，否则判定为阴性，一般需要3个小时完成实验。该方法的核心技术包括反应体系和反应程序两部分，反应体系的关键是引物和探针的核苷酸序列及其与酶类和盐类的配制比例， 各种试剂必须按其推荐的比例进行配制；反应程序的关键是控制好最佳退火和延伸时间。该方法虽然准确快速，但由于实验所需的检测试剂盒及荧光定量PCR仪比较昂贵，导致检测成本较高。方法二是采用测序法，以核苷酸的克隆和序列检测技术为基础，为常规序列分析方法。该方法需要的试剂包括特异性扩增引物、核酸提取试剂盒、通用的PCR试剂盒、核酸纯化试剂盒、PMD-18T载体试剂盒及DH5 α大肠杆菌，需要的仪器包括PCR仪、离心机、紫外透射仪、恒温培养箱，具体操作步骤是先用特异性引物扩增待检样品核酸的特异基因片段，将目的基因片段纯化后克隆入PMD-18T载体，再将克隆好的载体送往测序公司进行测序，最后将测得序列与高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒(JXAl-R疫苗株)进行比对，与疫苗毒核酸同源性较高，且特殊位点未发生变异的，则判定为JXAl-R株，检测一次一般需要7~10天时间。同样存在成本高的问题，另外检测周期也较长。
技术实现思路
为了解决现有技术中的上述问题，本专利技术提供了一种简单快速的检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法。PRRSV的基因组全长约15kb，含有9个开放阅读框(ORFs)，顺序依次为5’ -0RF1a-0RFlb-0RF2a-0RF2b-0RF-(3-7)3’。每个阅读框与相邻的阅读框均有少量的重叠。通过BLAST软件将JXAl-R疫苗株与2010年前(2010年开始使用JXAl-R株弱毒疫苗)NCBI上发表的PRRSV的其他毒株核苷酸序列进行比对，发现JXAl-R疫苗株在其ORFla 3195~3682位基因序列中特异缺失限制性核酸内切酶fee II的酶切位点，本专利技术利用限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)分析技术原理，通过这一特殊缺失的酶切位点，结合 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，逆转录PCR)方法，对高致病性的猪蓝耳病JXAl-R疫苗株进行鉴别检测，即能准确鉴别JXAl-R疫苗株与其他PRRSV感染样品。本专利技术的具体技术方案如下: 一种检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法，是采用RFLP分析法，设计合成扩增猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段的引物，提取待检样品中的RNA，通过RT-PCR，用所述引物扩增JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段，扩增产物与限制性核酸内切酶fee II进行酶切反应，酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后出现长度487bp的条带时判断为待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株。作为一种优选方案，上述检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法中，所述RT-PCR为一步法RT-PCR，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~2所示。本专利技术还提供了一种检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒，该试剂盒包括SEQID NO: 1~2所示的引物核苷酸序列和限制性核酸内切酶5^ II。作为一种优选方案，上述检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒，由一步法RT-PCR反应液和酶切反应液两组试剂组成，其中: 一步法RT-PCR反应液:10倍稀释的PCR缓冲液5PL，5U/^L的DNA聚合酶?μ?，200υ/μ?的反转录酶 lKL，IOmM 的 dNTPslPL，200υ/μ? 的 RNA 酶抑制剂 ?μ?，25mM 的 MgCl2 8μ?, 20μΜ的SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2所示的引物核苷酸序列各?μ?，以及无RNA酶灭菌水28μ? ; 酶切反应液:0.l%(w/v)BSA (牛血清白蛋白)2μ?, 10倍稀释的酶切反应缓冲液2μ?，限制性核酸内切酶fee II IμL，灭菌双蒸水5PL; 所述PCR缓冲液由Tris-HCl (三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐)、KCl和MgCl2的混合水溶液组成，pH值为8.5，其中Tris-HCl浓度为IOOmM, KCl浓度为500nM, MgCl2浓度为15nM ；所述酶切反应缓冲液由醋酸镁、二硫苏糖醇和醋酸钾的混合水溶液组成，其中醋酸镁的浓度为IOOmM, 二硫苏糖醇的浓度为5mM，醋酸钾的浓度为660mM。本专利技术还提供用上述检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的试剂盒检测猪蓝耳病活疫苗JXAl-R株的方法，是将待检样品提取RNA后使用所述一步法RT-PCR反应液进行扩增，RT-PCR反应程序为:50°C 30分钟；94°C 2分钟；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分钟，共40个循环；72°C，延伸8~10分钟；取部分扩增产物加入到酶切反应液中，37°C下反应I小时；终止反应取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过拍照观本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪蓝耳病活疫苗JXA1?R株的方法，其特征在于，采用RFLP分析法，设计合成扩增猪蓝耳病活疫苗JXA1?R株ORF1a?3195～3682位核苷酸片段的引物，提取待检样品中的RNA，通过RT?PCR，用所述引物扩增JXA1?R株ORF1a?3195～3682位核苷酸片段，扩增产物与限制性核酸内切酶SacⅡ进行酶切反应，酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后出现长度487bp的条带时判断为待检样品中含有猪蓝耳病活疫苗JXA1?R株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋志军，祝卫国，王东东，罗小飞，宋延华，
申请(专利权)人：广东温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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