粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法技术

本发明专利技术涉及一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法。所述方法包括：在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理0～21天，然后再进行萌发。本发明专利技术提供了一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括了基于体细胞胚颜色变化的干化标记策略，能够极显著地提高体细胞胚的萌发率；同时，体细胞胚萌发的质量也得到明显提高；而且不会受到基因型和细胞系的影响，具有普遍的适用性；为实现粗枝云杉体细胞胚的工厂化育苗奠定了理论基础，并提供了切实可行的技术方案。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种。所述方法包括：在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理0～21天，然后再进行萌发。本专利技术提供了一种，包括了基于体细胞胚颜色变化的干化标记策略，能够极显著地提高体细胞胚的萌发率；同时，体细胞胚萌发的质量也得到明显提高；而且不会受到基因型和细胞系的影响，具有普遍的适用性；为实现粗枝云杉体细胞胚的工厂化育苗奠定了理论基础，并提供了切实可行的技术方案。【专利说明】
本专利技术涉及林业中细胞工程种苗繁殖领域，具体地，涉及一种。
技术介绍
植物体细胞胚胎发生技术，是指在离体条件下，已分化的体细胞在特定的环境条件下，发育成与合子胚类似的胚状体的过程。植物体细胞胚胎发生是利用细胞工程手段实现植株再生的重要途径之一，作为一种利用人工手段能够最大限度地实现植物扩繁的措施，尤其对于难以扦插繁殖且繁殖周期较长的针叶树树种来说具有巨大的应用价值。同时， 由于体细胞胚和合子胚具有相似的形态结构和发育过程，体细胞胚胎发生过程又具有相对的遗传稳定性；开展植物体细胞胚胎发生的研究，已经为揭示植物胚胎的发生机理研究和开展遗传转化研究提供了一种模式研究系统。一个完整的植物体细胞胚胎发生技术包括胚性愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的增殖、体细胞胚的分化和成熟体细胞胚的萌发等四个阶段；其中，成熟体细胞胚的萌发阶段作为整个技术体系的最后一步，体细胞胚萌发率的高低及萌发质量，直接决定着最终体胚苗的收获量和整个体胚技术体系构建的成败。目前，在针叶树树种体细胞胚萌发阶段， 为提高体细胞胚的萌发率和萌发质量，国外常用的方法是将体细胞胚萌发之前进行干化 (Desiccation)预处理。通常，失水现象是体细胞胚由成熟阶段向萌发阶段转变的最直接响应，可以促使体细胞胚由形态成熟向萌发所需的生理成熟转变；因此，对体细胞胚而言，给予适当的干化失水处理，不仅能够抑制分化培养基中体细胞胚的提早萌发，还能够提高体细胞胚在萌发阶段中的萌发数量和质量。一般根据体细胞胚失水速率的变化，可以将体细胞胚的干化处理方法分为完全干化(Full Desiccation)和部分干化(Partial Desiccation)两种；前者主要由渗透压调节物质实现，而后者主要通过水蒸气变化调节。尽管干化处理能够提高萌发频率，然而影响干化处理效果的因素有很多:干化方法的差异、干化处理持续的时间、树种的不同、甚至相同树种不同基因型之间对相同干化处理方法的响应都存在很大差异。如果不考虑影响干化处理效果的因素，采用单一的干化处理条件，肯定不能够满足所有基因型或者细胞系体细胞胚的萌发需要。因此，国外有学者甚至提出，每一个细胞系都可能对应一个独一无二的干化处理方案，若想建立合适的干化处理方案，需要对每个细胞系的体细胞胚干化条件逐一探索。这种逐一探索的方法费时费力，在实际生产中可行性较差。粗枝云杉(Picea asperata Mast)为松科,云杉属树种，国内俗称云杉,为我国特有种，也是我国分布最广的云杉属树种。常绿乔木，高达45m，胸径达lm。主要分布于川西高原、甘肃东南部和陕西西南部的亚高山地区，平均海拔分布在2400~3600m的高山丘陵地带。木材黄白色，较轻软，纹理直，结构细，有弹性。是重要的造纸、建筑、家具及木纤维工业的原材料。材质优良，生长快，适应性强，是分布区的主要造林树种。目前，人工造林用苗 主要通过实生繁殖，但粗枝云杉结实晚，种子成熟率低，且伴有严重的“大小年”现象，致使粗枝云杉优良种苗供不应求。在过去几年，本申请的专利技术人尝试首次构建粗枝云杉体细胞胚胎发生技术体系。 在此过程中，胚性愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的增殖、体细胞胚的分化等阶段的技术体系已经非常成熟，并符合生产需要。然而，在体细胞胚的萌发过程中，尽管经过大量的探索工作，对影响体细胞胚萌发的因素做了尽可能多的尝试，筛选出的萌发条件虽能显著地提高粗枝云杉体细胞胚的萌发率，但是萌发率还是不够高(平均为20%左右)，仍然不能尽可能高地满足实际生产的需要。因此，若能在粗枝云杉体细胞胚萌发之前，确定其合适的干化处理方法，可以极显著地提高体细胞胚的萌发率和明显提高体细胞胚萌发的质量；并且该处理方法如果不会受到基因型和细胞系的影响，具有普遍的适用性，将为实现粗枝云杉体细胞胚的工厂化育苗， 提供了巨大的应用前景。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题，本专利技术的目的是提供一种。为了实现上述目的，本专利技术提供的，包括:在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理O~21天，然后再进行萌发。本专利技术所述的方法，优选对体细胞胚采用“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理。本专利技术所述的方法，更优选对体细胞胚采用“滤纸法”的方式进行干化处理。其中，所述的“滤纸桥法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，用滤纸覆盖在放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器上做成“滤纸桥”，最后将更大的培养容器封口。其中，所述的“空培养容器法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内， 在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口。其中，所述的“滤纸法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个垫有一层以上滤纸的培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口。其中，所述的“滤纸法”中，放置粗枝云杉体细胞胚的培养容器内垫有滤纸的层数优选I~4层，更优选3层。本专利技术中，在培养容器内放置的滤纸可以大小相同，也可以不同，但最好相同。本专利技术中，所用的培养容器可以为塑料培养皿或玻璃培养皿，优选玻璃培养皿。本专利技术所述的方法，优选干化处理I~14天，更优选7~14天，最优选14天。其中，对体细胞胚进行干化处理的条件还包括:温度为23~25°C ;光照强度为 15 ~18 μ mo I.m 2.s S 优选 15 μ mo I ^m2-S10其中，采用液体悬浮`增殖或半固体增殖的胚性愈伤组织分别进行体细胞胚的分化培养，获得粗枝云杉的体细胞胚。本专利技术所述的，还包括:在对粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理后，对体细胞胚进行干化标记，然后再进行萌发。其中，对体细胞胚进行干化标记的方式为:根据干化处理后体细胞胚颜色的变化， 将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。进一步地，对标记为“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。更进一步地，对标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。本专利技术提供的，包括:在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理O~21天，对体细胞胚进行干化标记，然后再进行萌发。其中，对体细胞胚进行干化标记的方式为:根据干化处理后体细胞胚颜色的变化， 将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括：在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理0～21天，然后再进行萌发。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王军辉，张建伟，张守攻，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：