表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用技术

表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用，本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及基因工程技术领域。本发明专利技术的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗。本发明专利技术首先提供了一种重组BCG活菌菌株，是将编码人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类p53优选基因序列导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株；本发明专利技术还提供了该重组菌株的构建方法以及由其得到的活菌疫苗。该活菌菌株能够在细胞中表达分泌出人类p53蛋白，动物学实验证明，将其作为疫苗接种机体后，可以起到预防和治疗癌症的作用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用，本专利技术涉及生物
，特别涉及基因工程
。本专利技术的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗。本专利技术首先提供了一种重组BCG活菌菌株，是将编码人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类p53优选基因序列导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株；本专利技术还提供了该重组菌株的构建方法以及由其得到的活菌疫苗。该活菌菌株能够在细胞中表达分泌出人类p53蛋白，动物学实验证明，将其作为疫苗接种机体后，可以起到预防和治疗癌症的作用。【专利说明】表达分泌人类P53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用基因工程技术构建获得的能够表达分泌人类P53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗以及其构建方法和应用。
技术介绍
癌症是威胁人类健康和生命的杀手，每年因患恶性肿瘤致死的病例已经上升到各种疾病的首位。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗。尽管医学家们不断完善这3大治疗手段，但许多癌症患者仍然难以得到治愈。由于肿瘤本身易转移和复发，使传统的手术、放疗和化疗效果有限。目前，肿瘤免疫治疗已成为一种比较有效的治疗方法。肿瘤的免疫治疗包括抗体、细胞因子、疫苗和细胞治疗。它是一种新型的主动性免疫疗法。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展，肿瘤与机体之间的相互作用、肿瘤免疫耐受以及肿瘤抗原鉴定都取得了很大的进展，这也促进了肿瘤疫苗的发展。目前，很多抗肿瘤疫苗在动物水平和临床试验已取得令人鼓舞的效果。作为一种高效、无明显毒副作用的肿瘤免疫疗法已经成为了人类预防和治疗肿瘤疾病的必然趋势。人类P53基因是功能最强大的一种抑癌基因，p53蛋白对细胞周期和凋亡起关键性作用，尤其是对受辐射、细胞毒制剂、热疗打击的癌细胞，起更大的杀伤作用。人类P53基因也是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。人类P53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。突变型P53基因具有促进细胞增殖的活性，导致细胞异常增殖，参与肿瘤形成。正常的人类P53基因功能的改变或缺失与大量不同种类的人类肿瘤细胞有密切关系。人类p53蛋白被认为是细胞应激的关键性调控分子之一，能整合各种不同的细胞危急事件的信号，通过转录或非转录途径对这些信号作出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应。有研究认为正常人类P53蛋白在体内扮演“分子警察”的角色，监视细胞基因组的完整性。因此，维持和修复人类P53基因功能在预防和治疗人类肿瘤疾病中有着重要意义。BCG (Bacillus Calmette_Gu6rin)作为预防结核病的疫苗已经得到广泛的使用。BCG作为重组疫苗载体具有其他疫苗载体不可比拟的优越性。BCG在全世界范围内应用最广泛，它是一种耐热活疫苗，生产成本低，且应用于实验动物和人体并发症少。因此，把BCG作为活菌疫苗载体，是目前构建重组疫苗的理想选择。人类P53蛋白是基因组的守卫，当DNA损伤发生时，p53蛋白会阻止细胞增殖直到损伤被修复后。人类癌细胞中的P53蛋白发生突变，失去了保护作用。因此，如果能够使用BCG作为疫苗载体构建表达分泌人类p53蛋白的活菌疫苗，将其接种机体后使之持续表达分泌人类p53蛋白，维持和恢复p53蛋白的功能，将有望达到高效预防和治疗人类肿瘤疾病的发生的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗，特别是提供一种具有表达分泌与人类肿瘤疾病密切相关的人类P53蛋白的重组BCG活菌疫苗。为实现上述目的，本专利技术首先提供了一种重组BCG活菌菌株，其特征在于:是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类P53优选基因序列导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。进一步地,所述人类p53优选基因序列具有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。进一步地，所述人类p53优选基因序列的上游连接有核苷酸序列如SEQ IDNO: 3所示的BCG分泌信号肽基因序列，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。进一步地,所述重组BCG活菌菌株是将具有核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示的基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株。本专利技术还提供了上述重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤:(I)根据编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列以及BCG基因组对密码子的偏好性设计和人工合成适合于BCG表达的具有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的人类P53优选基因序列；(2)将具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的BCG分泌信号肽基因序列连接到上述人工合成的人类P53优选基因的上游，组成上游具有BCG分泌信号肽序列的人类p53优选基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；(3)利用限制性内切酶和链接酶将上述人工合成的上游具有BCG分泌信号肽序列的人类P53优选基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，并转化到大肠杆菌E.coliT0P10中，获得正确的重组转化子；(4)将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定及测序鉴定阳性转化子；(5)将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Western blot鉴定表达的人类p53蛋白情况。进一步地，上述构建方法中所使用的BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为P丽234穿梭表达载体。本专利技术还提供了一种活菌疫苗，其特征在于:所述活菌疫苗中含有上述重组BCG活菌菌株。本专利技术还提供了上述重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用，其应用方法是将该重组BCG活菌菌株辅以药学上可接受的佐剂制备成疫苗，该疫苗可单独使用也可联合其他药物或者放疗化疗一起使用，使用时经皮内注射，注射量以BCG活菌个数计为IO6CFU/人，可一次注射，也可分多次注射。有益效果:`本专利技术对人类p53基因序列进行改造，并成功导入BCG活菌菌株中得到了能够在BCG细胞中表达分泌出人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株。利用该重组BCG活菌菌株制备而成的活菌疫苗，经Western blot检测结果显示,该活菌疫苗可以胞外表达人类p53蛋白，并能被人类P53蛋白抗体识别。将其接种人体后，可以在体内持续表达分泌人类p53蛋白，使得人体内的P53蛋白得到补充，从而起到对癌症的预防和治疗作用。本专利技术提供的重组BCG活菌疫苗可作为新型的人类癌症疾病预防性疫苗应用于对癌症疾病的预防。【专利附图】【附图说明】图1是重组人类p53优选基因和BCG分泌信号肽基因穿梭表达载体p丽_p53的物理图谱；图2是本专利技术重组BCG胞外表达人类p53蛋白的Western blot鉴定图；图3是本专利技术活菌疫苗治疗A549肺癌小鼠模型细胞数变化结果；图4是本专利技术活菌疫苗治疗A549肺癌小鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组BCG活菌菌株，其特征在于：是将编码氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的人类p53蛋白的人类p53基因序列参照BCG基因组对密码子的偏好性进行改造后所获得的人类p53优选基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡章立，李勇，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：