一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，是用来自吸水链霉菌CCTCC?M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母得到基因工程菌，并用基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。本申请构建的基因工程菌具有谷氨酰胺转胺酶酶原表达量高的优点，适于在工业生产中应用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】，是用来自吸水链霉菌CCTCC?M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母得到基因工程菌，并用基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。本申请构建的基因工程菌具有谷氨酰胺转胺酶酶原表达量高的优点，适于在工业生产中应用。【专利说明】
本专利技术涉及，属于酶工程
。技术背景微生物谷氨酞胺转胺酶(TransglutaminaseEC2.3.2.13 全称 R-glutaminyl-peptide: amine- Y -glutayle-transferase简称TGase),能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的Y-羧酰胺基与各种酰基受体发生酰胺基转移反应，形成ε-(Υ-谷氨酰基)赖氨酸共价键，引起蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酞胺基的水解。目前，链霉菌TGase已广泛用于食品工业，适量添加TGase可显著改善各类食品蛋白质的功能性质和营养价值，应用范围包括肉制品、水产品、乳制品、植物蛋白制品等。此外，TGase在一些非食品工业领域也具有较大的应用前景，如组织工程、纺织工业及生物学研究等。然而，依靠优势菌种选育和过程优化的传统发酵技术对TGase产量的提高已十分有限，远不能满足市场需求。在前期研究中，本研究室筛选出一株产谷氨酰胺转胺酶(简称TGase)的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062),通过基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子(Genebank:EU477523),并实现了 MTG和其酶原区在大肠杆菌中的高效表达(Liu S，Zhang D, Wang M, Cui W，ChenK, Liu Y, Du G, Chen J, Zhou Z (2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicustransglutaminase affects its secretion by Escherichia col1.FEMS MicrobiolLett324(2):98-105)。`解脂耶氏酵母于1942年首次被分离得到，先后被命名为Candida lipolytica、Endomycopsis lipolytica、 Saccharomycopsis lipolytica,最终定名为 Yarrowialipolytica(解脂耶氏酵母)。解脂耶氏酵母是研究的最广泛的非常规酵母之一，曾相继用于工业化规模生产单细胞蛋白、柠檬酸。由于它具有很强的分泌蛋白的能力，因此是一种很有潜力的表达异源蛋白的宿主生物。由于强有力的基因扩增系统的发展，逆转录转座子的发现，调控型和组成型的强启动子的鉴定，近年来解脂耶氏酵母作为异源蛋白表达宿主的研究进展很快，迄今已有42个异源蛋白在解脂耶氏酵母中得到了表达，而且大多数蛋白的表达都能达到晕克/升。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种高效表达谷氨酰胺转胺酶酶原的基因工程菌，是用来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原(proTG)，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母 Yarrowia lipolytica WSH-Z06,得到基因工程菌 pINA1297_proTG/Y.lipolyticaWSH-Z06。本专利技术所使用菌种为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica WSH-Z06,来源于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M207143。本专利技术还提供了一种利用上述重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，步骤如下:1)扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原(proTG)的PCR产物；2)将回收的proTG的PCR产物片段和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段进行柱回收，酶切质粒PINA1297进行胶回收，将二者连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子；3)将经验证构建成功的重组质粒pINA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母；4)利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。proTG可扩增自本实验室前期构建载体pET22b(+)/proTG (已发表文章)或根据Genebank:EU477523相关信息人工合成。具体而言，重组菌株构建方法如下:(l)proTG 引物设计根据pET22b(+)/proTG基因序列设计proTG基因的PCR引物Pl和P2。Pl:5’ -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3’ (SfiI)P2:5 ’ -CGCGGATCCTTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’ (BamHI)(2)重组表达载体pINA1297_proTG的构建利用引物Pl，2，以pET22b(+)/proTG质粒为模板，扩增得到proTG的PCR产物，按照Fermentas的胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，将回收到的片段和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，50°C，lh，然后加入KpnI酶切，37°C，45min后，酶切片段进行柱回收，酶切质粒PINA1297进行胶回收，将二者按一定比例连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经SfiI单酶切，50°C, Ih,再经KpnI酶切，37°C，45min，释放出大小为5.2kb和1.1kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为P INA1297-proTG。(3)重组质粒 P INAl297_proTG 转化菌株 Y.lipolytica WSH-Z06将经验证构建成功的重组质粒P INA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至菌株Y.lipolytica WSH-Z06中。转化方法为醋酸锂法。(4)转化子基因组插入片段检测挑取YNB平板上单菌落接种于YPD液体培养基中，提取菌株的基因组DNA，具体操作步骤按照天根提酵母基因组试剂盒说明书进行。以Pl，2为引物，基因组DNA为模板，进行PCR验证。本专利技术所用到的培养基:LB 培养基:胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，ρΗ7.0 ；YPD培养基:葡萄糖2.0g，蛋白胨2.0g,酵母菌粉1.0g,溶于100.0ml蒸馏水中，固体培养基另加入琼脂2.0g。YNB培养基YNB-N5wtl (w/v):0.17%酵母提取物(不含氨基酸与硫酸盐)，葡萄糖.1.0%，硫酸铵0.5%。其中葡萄糖单独灭菌，然后充分混合。固体培养基需要加入2.0%的琼脂粉。PPB 培养基(w/v):蔗糖 2.0%,酵母菌粉 0.132%, NH4C10.132%, KH2PO4 0.032%,MgSO4.7H20 0.024%，硫胺素0.33mg/ml，溶于终浓度为0.02M的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ρΗ6.0)中。pro-TGase 的活化:取100本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效表达谷氨酰胺转胺酶酶原的基因工程菌，其特征在于，用来自吸水链霉菌CCTCC?M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，构建重组表达载体pINA1297?proTG，并将其转化解脂耶氏酵母，得到基因工程菌pINA1297?proTG/Y.lipolytica?WSH?Z06。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，王淼，刘松，万丹，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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