用于动物细胞的表达载体制造技术

本发明专利技术涉及用于动物细胞且具有增强的基因表达能力的表达载体。更具体而言，本发明专利技术涉及用于动物细胞的表达载体，其包括作为基因表达增强因子的MAR因子和SAR因子，所述元件位于启动子的5'端或转录终止因子的3'端或者位于启动子的5'端和转录终止因子的3'端上。根据本发明专利技术的用于动物细胞的表达载体与传统的用于动物细胞的表达载体相比，呈现显著增加的基因表达能力，因此，可以显著增加外源基因的蛋白表达。特别地，根据本发明专利技术的用于动物细胞的表达载体即使没有MTX增强也可以确保获得高表达细胞系，因此非常有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及用于动物细胞且具有增强的基因表达能力的表达载体。更具体而言，本专利技术涉及用于动物细胞的表达载体，其包括作为基因表达增强因子的MAR因子和SAR因子，所述元件位于启动子的5'端或转录终止因子的3'端或者位于启动子的5'端和转录终止因子的3'端上。根据本专利技术的用于动物细胞的表达载体与传统的用于动物细胞的表达载体相比，呈现显著增加的基因表达能力，因此，可以显著增加外源基因的蛋白表达。特别地，根据本专利技术的用于动物细胞的表达载体即使没有MTX增强也可以确保获得高表达细胞系，因此非常有用。【专利说明】用于动物細胞的表达载体
本专利技术涉及用于动物细胞的具有增强的基因表达效率的表达载体。
技术介绍
为了获得过表达的靶蛋白，以将获得的靶蛋白用于医学和エ业等，使用了多种表达系统，例如，微生物表达系统、植物表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、动物细胞表达系统等等。其中，微生物表达系统是最容易使用的系统，并已发展为适用于多种应用且商业化的表达系统。然而，微生物表达系统存在多个限制因素。主要的限制因素是，由于微生物的蛋白表达和修饰机理(糖基化、磷酸化、酰胺化)与动物细胞不同，即使在微生物表达系统中表达相同的基因，所表达的蛋白的结构或特性与原始蛋白也不完全相同。因此，在利用微生物表达系统制备重组蛋白质时，由于几乎没有产生合成后修饰，也不产生所制备的蛋白的失活或显著功能差异，但频繁表达修饰的蛋白质或结构上有部分差异的蛋白质。此外，使用微生物表达系统的重组蛋白质制备过程存在困难，因为由于微生物污染、微生物内毒素污染等，需要进行二次污染物的消除过程。另ー方面,虽然动物细胞表达系统是最合适的动物蛋白表达系统,与微生物表达系统相比，动物细胞表达系统由于重组蛋白的表达效率低且动物细胞的操作过程难导致其生产成本高，这使得动物细胞表达不容易エ业化。目前使用的エ业化的动物细胞系有CHO(Chinese Hamster O vary,中国仓鼠卵巣)细胞、BHK (Baby Hamster Kidney,幼仓鼠肾)细胞、骨髄瘤(myeloma)细胞等。可以通过在这些动物细胞系中转染包括相应基因的表达载体来表达目标外源蛋白。在包括糖基化的各种蛋白质修饰机制保留在动物细胞中且蛋白质被分泌到培养基中的情况下，可以容易地进行蛋白质的获得和纯化过程。在培养过程中，大多数动物细胞必然需要如血清蛋白等复合添加物，但由于CHO细胞可以在不添加血清和蛋白的培养基中培养，CHO细胞可以作为最合适的宿主细胞用于重组蛋白表达。此外，由于已经进行了大量关于CHO细胞的研究，CHO细胞具有优势，因此其特性是众所周知的:生长速度快且可以进行用于大规模培养的悬浮培养(suspension culture)。通常，当使转基因表达于动物细胞时，同时转染(transfection)转基因和具有标记(marker)的载体，在选择性培养基中培养并筛选转染的细胞。然而，在大多数情况下，其表达频率显著的低。其中ー个原因是，不同于微生物系统，在动物细胞中，这些转基因应整合到宿主细胞染色体中。而且，即使筛选出转基因稳定地整合到宿主细胞染色体中的稳定转染子(stable transfectants),仍难以预测其表达量。原因是,基因在姆个细胞中的整合位点是不同的，并且根据整合位点，其表达模式也不同。因此，转基因的数量和整合到动物细胞中的转基因的表达量二者之间没有明确的相关性(Grindley等人，1987，TrendsGenet.3, 16-22;Kucherlapati 等人，1984，Crit.Rev.Biochem.16, 349-381;Palmiter 等人，1986，Annu.Rev.Genet.20, 465-499)。在大多数情况下，动物细胞中的基因表达被整合位点周围的DNA碱基所抑制，因此，即使是在稳定整合的转基因(stably integratedtransgenes)的情况下，表达也是以显著低的水平表达(Eissenberg等人，1991，TrendsGenet.7, 335-340;Palmiter 等人,1986, Annu.Rev.Genet.20, 465-499)。已经报道了各种系统中用于保护转基因表达免受上述的基因位点特异性影响的可用的DNA因子。对于上述DNA因子，可以使用绝缘子(insulator)因子、核基质附着区(nuc Iear matrix attachment region,以下，称为 “MAR”)、核骨架附着区(scaffoldattachment region,下文中，简称为“SAR”)等。虽然其作用机制尚未阐明，但当转基因(transgen e)构建体中包括DNA因子时，其能诱导基因表达而与整合位点无关，并且基因的拷贝数决定表达量(McKnight, R.A.等人，1992，Proc.Natl.Acad.US.89，6943-6947)。KALOS等人将人载脂蛋白(apolipoprotein) B基因的MAR元件与最小启动子转基因构建体(min imal promoter transgene construct)相结合并在动物细胞中诱导基因表达,使转录物的表达增加约200倍(Kalos等人，1995，Mol.Cell.Biol.15，198-207)。相似地，据报道，鸡溶菌酶(chicken lysozyme) A基因的MAR元件，人干扰素0 (interferon 0 )的SAR元件等赋予了在脊椎动物中的转基因表达，而与在宿主细胞染色体上的整合位点无关(Eissenberg 等人,1991, Trends Genet.7, 335-340;Klehr 等人,1991, Biochemistry3。，1264-1270)。然而，还尚未见到利用如上所述的具体的P球蛋白MAR元件、具体的MAR/SAR元件或者具体的干扰素3 SAR元件的组合来尝试大幅提高细胞系中蛋白产量或者确保エ业利润的报道。本
技术介绍
中所公开的信息仅仅是为了改善对本专利技术背景的理解。因此，本专利技术不包括本领域所属技术人员已知的现有技术的信息。
技术实现思路
本专利技术的ー个目的是提供用于动物细胞的表达载体，其包括至少ー个拷贝的MAR元件和SAR元件,所述元件位于启动子的5’端和/或转录终止位点的3’端,所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。本专利技术的另ー个目的是提供转染了用于动物细胞的表达载体的重组动物细胞。本专利技术的再ー个目的是提供使用了用于动物细胞的表达载体的靶蛋白制备方法。根据本专利技术的ー个方面，提供了用于动物细胞的表达载体，其包括至少ー个拷贝的MAR元件或SAR元件,所述元件位于启动子的5’端和/或转录终止位点的3’端,所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。根据本专利技术的另ー个方面，提供了用于动物细胞的表达载体，其包括选自由位于启动子的5’端和/或转录终止位点的3’端的至少ー个拷贝的P球蛋白MAR元件、CSP-BSAR元件以及干扰素3 SAR元件所组成的组中的基因表达增强因子，所有所述基因表达增强因子在表达载体内均有效地相互连接。根据本专利技术的另ー个方面，提供了用于动物细胞的表达载体，其包括MAR元件以及SAR元件，所述元件是基因表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹在承，白光熙，卞泰镐，朴贞洙，
申请(专利权)人：盼展生物技术有限公司，
类型：
国别省市：