本发明专利技术公开了一种特异性沙门氏菌系列诊断血清工程菌株的构建方法，它是利用现代分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，构建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；将不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到适合表达的载体中，并转入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遗传背景，含有不同病原微生物特异性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。利用上述技术体系能够构建一个包含若干种沙门氏菌的特异抗体库。该抗体库可补充现有抗血清种类，同时也可为其他免疫学技术的应用提供基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，它是利用现代分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，构建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；将不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到适合表达的载体中，并转入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遗传背景，含有不同病原微生物特异性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。利用上述技术体系能够构建一个包含若干种沙门氏菌的特异抗体库。该抗体库可补充现有抗血清种类，同时也可为其他免疫学技术的应用提供基础。【专利说明】
本专利技术属于生物制品
，涉及能够制备特异性沙门氏菌系列诊断血清的工程菌株，更具体说是一种能够制备特异性沙门氏菌H: k诊断血清的工程菌株及构建方法。
技术介绍
沙门氏菌{Salmonella)属于肠杆菌科(feieroAacieriaceae),是革兰氏阴性菌。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由沙门氏菌属{Salmonella)中的不同血清型感染各种动物而引起的多种疾病的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。鞭毛(flagella)是革兰氏阴性细菌表面的一种附属结构，负责细菌的运动。不同种类的细菌以及同一种细菌的不同血清型所含有的鞭毛数量也不同，从几根到数十根，最长可达70 μ m，直径一般为10~20 nm。除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多沙门氏菌有周身鞭毛。将有动力的沙门氏菌穿刺接种于半固体培养基，它将沿穿刺线向周围扩散生长。沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O)抗原、鞭毛⑶抗原和表面抗原(荚膜或包膜抗原)三种抗原。鞭毛抗原(H抗原)是沙门氏菌等革兰氏阴性菌表面的主要抗原之一，其血清学水平上的变异在种内分型上有重要意义。沙门氏菌的鞭毛蛋白是由或/7及基因编码的，约1.5 kb。沙门氏菌的H抗原分为第一相和第二相。一相由/VjT编码,二相由/7及编码，这两个基因通过相位变异机制协同表达。Kauffmann-White抗原表根据沙门菌菌体抗原和鞭毛抗原的不同将沙门菌描述成许多不同的血清型。目前已确认沙门氏菌有2500个以上的血清型。沙门氏菌诊断血清是用沙门氏菌属的代表菌株制成灭活菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收除去非特异性凝集素后制成，供凝集试验诊断各型沙门氏菌用。研制沙门氏菌诊断血清一直是生物制品领域的热门课题。传统制备诊断血清的方法包括免疫原及免疫血清的制备，吸收与检定及稳定性试验等相关步骤已经非常成熟。但传统方法耗时长，工作量大。且获得的是多克隆血清，其特异性不高，常发生一些交叉反应。所以研究开发新的方法已是迫在眉睫。本专利技术即是对传统的血清制备体系的改造，不仅能快速制备出特异性强的诊断血清，而且还能实现交叉反应的有效去除和血清制备的标准化和工程化。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建能够制备特异性沙门氏菌H: k诊断血清的工程菌株； 本专利技术的目的通过以下技术方案实现: 一种能够制备特异性沙门氏菌H: k诊断血清的工程菌株，其特征在于:它是将含有编码鞭毛抗原k基因的重组质粒pTrC99a-/7iC(k)， 转入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙门氏菌中得到的能够有效表达鞭毛抗原k的工程菌株。更具体地说是将基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒PKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，得到相应的缺失菌株G4831 Δ fliC Δ fljB,然后再将构建的重组质粒pTrC99a-/7iC(k)转入其中，筛选得到能够有效表达鞭毛抗原k的工程菌株。本专利技术所述的能够制备特异性沙门氏菌H:k诊断血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831缺失后基因大小为IlOObp (氯霉素乙酰转移酶基因)，其序列为SEQ ID NO =10本专利技术所述的能够制备特异性沙门氏菌H:k诊断血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 ΛΛ/7及，缺失后基因大小仍为1500bp (卡那霉素抗性基因)，其序列为SEQ ID NO:2。本专利技术进一步公开了特异性沙门氏菌系列诊断血清工程菌株的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行: (1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的构建； (2)重组质粒PTrcgga-ZYiCr(k)的构建； (3)含有重组质粒pTrc99a-/7iC(k)的克隆菌株的构建。本专利技术利用现代分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，构建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；将不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到适合表达的载体中，并转入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遗传背景，含有不同病原微生物特异性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。用制备的工程菌抗原免疫动物，用具有相同遗传背景但不含鞭毛抗原的宿主菌吸附除去非目的抗体，能够实现交叉反应的有效去除和抗体制备的标准化和工程化。利用本专利技术的技术可以获得能够制备特异性H:k，H:r, H:y, H:z, H:ζ6, Η:zlO, Η:zl3, Η:zl5, Η:z28, Η:z29, Η:v, H:w, H:6 等多种沙门氏菌诊断血清的工程菌株。本专利技术更加详细的构建方法如下:1、表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831 Δ fliC Δ flJB)的构建 本专利技术选用本实验室编号为G4831 (格罗斯出浦沙门氏菌)为目的菌株，利用噬菌体λ的Red重组系统介导鞭毛基因和/7及的缺失。现针对基因说明一下主要过程，先合成一对引物，每一条引物的5'端有39 bp与基因同源，3'端与抗氯霉素基因同源(用于筛选)，以抗氯霉素模板质粒pKD3 (Genebank AY048742)的氯霉素乙酰转移酶基因为模板，通过PCR扩增获得中间为一个约1033bp的氯霉素乙酰转移酶基因，其两端为39bp同源臂的线性打靶DNA片段，通过切胶回收纯化得到该片段。将该线性打靶DNA片段电击转化到提前导入Red重组系统的G4831中诱导Red重组系统适量表达，λ核酸外切酶结合到线性打靶DNA片段两39bp同源臂末端，酶切产生游离3'单链DNA区段，从而使两同源臂和G4831染色体间以链侵入的方式发生重组。线性打靶DNA片段插入到G4831染色体上基因两同源臂之间，而G4831染色体上两同源臂间的基因序列被其置换，从而完成了 fliC基因的缺失，得到的fliC 基因缺失菌株。本专利技术中的Red重组系统由pSim质粒完成，需要提前导入到目的菌株中。pSim质粒载有适用于很多肠道细菌的DNA重组系统，是一种温度敏感性质粒，在42°C时表达，温度高于32°C时即丢失。/7及基因的缺失是在基因缺失菌株基础上引入另一个抗性筛选片段完成的，和/7iC基因的缺失的原理相同。经过上述两次缺失，得到/7K基因和fljB基因均缺失的菌株。2、重组质粒 pTrc99a-/7iC(k)的构建 本专利技术通过比对ncbi上和鞭毛抗原k相关的fliC基因序列，经过比对分析设计/7K基因通用扩增引物，在两条引物的5 '端分别加入NcoI和BamH I的酶切位点。本专利技术选用pTrc99a这一低拷贝质粒作为克隆载体，以本实验室编号本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够制备特异性沙门氏菌H:k诊断血清的工程菌株，其特征在于：它是将含有编码鞭毛抗原k基因的重组质粒pTrc99a?fliC(k)，转入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙门氏菌G4831△fliC△fljB中得到的能够有效表达鞭毛抗原k的工程菌株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯露，蒋新蕾，王磊，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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