本发明专利技术提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-l功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-1功能结构域包含人细胞间粘附分子-1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1结构域。所示融合蛋白用于制备细胞因子诱导的杀伤细胞。本发明专利技术还提供了人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法及采用所述方法制得的细胞。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-l功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-1功能结构域包含人细胞间粘附分子-1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1结构域。所示融合蛋白用于制备细胞因子诱导的杀伤细胞。本专利技术还提供了人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法及采用所述方法制得的细胞。【专利说明】一种用于制备人细胞因子诱导的杀伤细胞的融合蛋白
本专利技术涉及生物技术及医学领域。具体地，本专利技术涉及一种用于制备人细胞因子诱导的杀伤细胞的融合蛋白以及所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法。
技术介绍
肿瘤发病率从有癌症记录以来，一直呈上升的趋势，特别是过去二三十年以来，肿瘤发病率以每年3% -5%的速度增长。随着肿瘤发病率的增长，针对肿瘤的治疗方案也在不断发展，免疫治疗是其中一种重要的治疗手段，此种治疗手段对于清除肿瘤患者体内残留的和转移的肿瘤细胞、防止肿瘤的转移和复发及提高患者的生存率具有重要的意义。在免疫治疗方法中，细胞生物治疗已经初露锋芒，并成为肿瘤治疗的重要发展方向。继淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)及CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(⑶3AK)后,细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer, CIK)的杀瘤作用日益受到重视。CIK细胞最早于1991年由美国斯坦福大学Schmidt wolf等首次报道，他们发现在多种细胞因子(干扰素、CD3单克隆抗体、白介素I和白介素2)作用下，外周血淋巴细胞可以被定向诱导并大量增殖成为肿瘤杀伤细胞。由于此类细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，因此具有T细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞(NK)的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤等优点。与其他过继性免疫治疗细胞相比，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤范围广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点。因此，CIK细胞被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选方案。`如何制得CIK细胞一直受到研究者的关注。Schmidt Wolf等使用常规密度梯度离心方法分离健康成人外周血，制备单个核细胞悬液，调整细胞浓度为I X IO6个/ml进行培养，于培养第I天在培养体系中加入lX103U/ml的干扰素- Y (Interferon-gamma,IFN-Y)，培养24小时后加入3X102U/ml的重组人IL-2、I X 102U/ml的重组人IL_l、50mg/ml的⑶3单克隆抗体，以后每3天更换一次新鲜培养液并补充重组人IL-2，并调整细胞浓度至2X IO8L'以获得CIK细胞。郝希山、任秀宝等将纤连蛋白(Fibronectin，FN)的活性片段作为细胞因子添加到CIK细胞培养体系中，得到的细胞群中含有高比例的在细胞表面同时表达⑶3、⑶56分子的细胞。CIK细胞体外大量增殖并获得强大的细胞毒活性与多种因素密切相关，这些因素包括细胞因子IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN和CD3单克隆抗体等。其中，IL-2是T细胞分泌的一种细胞因子(由133个氨基酸组成的多肽，相对分子质量约为15X103)，是人体免疫应答的核心物质，能促进所有亚型的T细胞增殖，是效应最强的细胞因子。虽然CIK细胞的体内杀瘤活性不依赖IL-2的存在，但在体外大量培养时，IL-2可促进CIK细胞增殖和杀伤活性。此外，CD3单克隆抗体(CD3McAb)，作为一种有丝分裂促进剂，可促进细胞增殖。在采自淋巴瘤患者外周血的CIK细胞中加入抗CD3单克隆抗体，并将其与多种淋巴瘤和白血病细胞株共孵育，可使得这些细胞株对于CIK细胞介导的溶细胞作用的敏感性明显增加。纤连蛋白(fibronectin, FN)是一种位于细胞外基质中的大分子糖蛋白，分子量约550KD。FN由成纤维细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞等合成并分泌，参与细胞黏附、迁移、凋亡、形态改变等过程，具有止血、损伤修复等功能。由于FN分子量大，全分子表达存在基因工程上的困难。因此人们试图表达FN功能多肽并研究其功能，以期代替FN。细胞与FN的连接由整联蛋白介导，主要是整联蛋白α 5 β 1，又称极晚期活化抗原VLA-5，可识别FN细胞结合结构域I (Cell-1)的RGD序列；整联蛋白α 4 β 1，即VLA-4，可以与细胞结合结构域II (Cell-1I)的CSl及CS5结合；硫酸软骨素蛋白聚糖及⑶44分子可与FN羧基端肝磷脂结合结构域(Heparin-1I)结合。美国专利第5198423号中成功构建了含有FN三个关键结构域的质粒，并转入大肠杆菌HB101/Pchl02 (FERM BP-2800)。研究表明，含有FN三个关键的功能结构域，即细胞结合域(cell binding domain)、肝磷脂域(heparin domain)和CS-1区域的多肽能够发挥FN的主要生理功能。该多肽可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。在培养淋巴细胞时加入该多肽和抗CD3抗体，该多肽能够与静息状态的T细胞表面整合素家族成员VLA-4、VLA-5相结合，抗CD3抗体可与T细胞上的TCR结合，两者共同作用激活酪氨酸激酶PP125FAK，然后通过Ras途径刺激T细胞的增殖和分化。吸附在培养介质上的重组该多肽可以在⑶3单克隆抗体的协同作用下刺激T细胞活化。细胞粘附分子(cell adhesion molecule, CAM)是介导细胞与细胞或细胞与外基质间相互接触和结合的膜表面糖蛋白。细胞间粘附分子-1 (intercellular cell adhesionmolecule-1, I CAM-1)是一种重要的细胞粘附分子，它由Rothlein等于1986年在研究淋巴细胞粘附时发现。人ICAM-1基因定位于染色体19 P 13.3-13.2区，长15.5kb，含7个外显子和6个内含子。人ICAM-1为经由长3.3kb的可诱导的mRNA编码的单链糖蛋白，属免疫球蛋白超家族。由于糖基化程度不同，不同种类细胞的ICAM-1分子量有所不同:介于76-114kD，其中核心多肽的分子量为55KD。在结构上ICAM-1分为细胞外功能区、跨膜区和胞质区。细胞外功能区由483个氨基酸组成，含有5个免疫球蛋白(Ig)样功能区，每个Ig样区由一个单独的外显子编码。信号肽和跨膜区及胞浆区分别由两个不同的外显子编码。其膜外NH2-端的第1、2功能区为淋巴细胞功能相关抗原-1 (lymphocyte functionalantigen-1, LFA-1)的结合部位。第2和第3结构域之间有一段连接序列，富含脯氨酸，类似免疫球蛋白的绞链区、可发生 扭曲。以此连接区为界，氨基端的1-1I结构域可结合LFA-1分子和鼻病毒，而羧基端侧的III结构域可以结合巨噬细胞分亿抗原-1分子(Mac-1)。LFA-1是ICAM-1的主要受体。Mac-1与ICAM-1的亲和力较低，且在激活的白细胞上只有一小部分Mac-1 (约10% )可介导ICAM-1粘附。ICAM-1的主要胞外功能结构域为NH2段1-1I结构域.经序列分析及文献检索，ICAM-1 N段Q28-T207的180个氨基酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为人细胞间粘附分子?l功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子?1功能结构域包含人细胞间粘附分子?1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS?1结构域。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑意端，
申请(专利权)人：深圳市阳溪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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