抗-分枝杆菌疫苗接种的功效的确定制造技术

本发明专利技术涉及测定疫苗，特别是结核疫苗的功效的方法和试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及测定疫苗，特别是结核疫苗的功效的方法和试剂。【专利说明】抗-分枝杆菌疫苗接种的功效的确定【
】本专利技术涉及测定疫苗，特别是结核疫苗的功效的方法和试剂。【
技术介绍
】每年，达2百万人死于结核(TB) (I)。针对TB唯一可利用的疫苗是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介苗(BCG),其在1921年首次用于人(2)。至今，已施用四十亿剂量的BCG，致使其成为世界上最广泛使用的人疫苗(3)。但是，我们仍远未达到达到TB的根除。BCG疫苗接种在婴儿中预防结核性脑膜炎和粟粒性TB (4)。但是，针对其他形式的TB，尤其是青少年和成年中的肺部TB的保护是非结论性的，如由元分析强调，其揭示成年中O~80%的保护性功效(5)。因此，迫切地需要针对TB的新疫苗。目前，临床试验中针对TB的新疫苗接种策略包括重组BCG以取代规范BCG以及亚单位疫苗和基于非复制病毒载体的疫苗以追加BCG引发(6) (7)。成为保护的基础的免疫学机理的鉴定可辅助用于TB防止的新疫苗接种策略的合理的设计。而且，此策略可揭示指示保护性免疫的生物标记，其可揭示临床TB疫苗功效试验中临床结果的标志物，由此减少它们的持续时间以及辅助在平行试验中测试更大量的疫苗候选体。聚焦于新感染的，TB患者的健康接触及聚焦于BCG-免疫接种的婴儿的观察研究已起始定议该生物标记(8)。尽管对于针对TB的免疫应答，保护性记忆的根本性的元件的进一步研究仍待阐明。在BCG疫苗接种之后，由于缺乏免疫显性抗原而抗原-特异性记忆⑶4T细胞难以检测。目前，最广泛使用的生物标记基于产生IFNy的⑶4T细胞的升高的频度。增加的证据拷问IFNy作为TB中保护的关联的价值(9，10)。毋庸置疑地IFNy在针对MTB的防御中起到关键的作用(11)，但单独IFNy的测定可不再被认为是保护性免疫的可靠的标志物。表达吞噬溶酶体逃 逸结构域的重组BCG株描述于W099/101496，其内容通过引用在本文合并。吞噬溶酶体逃逸结构域致使所述株自感染的宿主细胞的吞噬体通过穿孔吞噬体的膜逃逸。为了提供对于最佳吞噬溶酶体逃逸活性的酸性吞噬体pH，开发了脲酶-缺陷型重组株。此株公开于W02004/094469，其内容通过引用在本文合并。在临床前模型中，相比亲本BCG (pBCG)，表达单核细胞增多性利斯特菌(Listeriamonocytogenes)的膜-穿孔利斯特菌溶血素(Hly)和缺乏脲酶C的重组AureC Hly+rBCG(rBCG)株诱导抵御用MTB产气攻击的更优保护(12)。此疫苗构建体在I期临床试验中成功地证明了安全性和免疫原性(US61/384，375)，其内客通过引用在本文合并。在本研究中，显示rBCG和pBCG诱导显著的Thl免疫应答，而更显示仅rBCG引发是深刻的Thl7应答。也观察到在rBCG-免疫接种的小鼠的MTB感染后抗原-特异性T淋巴细胞向肺的更早募集。这些T细胞在再刺激之后产生丰富的Thl细胞因子。rBCG的更优保护性功效明显依赖于IL17。也在I期临床试验期间在健康自愿者中检测到在rBCG疫苗接种之后，但不是PBCG疫苗接种之后提升的IL17产生。我们的发现将通用的免疫学通路鉴定为用于针对TB的改善的疫苗接种策略的标志物，其也可由亚单位疫苗候选体探索。【
技术实现思路
】本专利技术的主题是测定疫苗功效的方法，包括測定免疫接种的受试者中的Thl7免疫应答，其中Thl7免疫应答的存在指不所述受试者中的保护性免疫。本专利技术的再一方面是测定疫苗功效的试剂盒，其包含至少ー种检测Thl7免疫应答的试剂。在优选的实施方式中，疫苗是活疫苗,特别是分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞。在甚至更优选的实施方式中，疫苗是重组分枝杆菌属(Mycobacterium),其包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含(a)能引发免疫应答的结构域及(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。能引发免疫应答的结构域优选是来自病原体的免疫原性肽或多肽或其免疫原性片段。在进ー步实施方式中，疫苗是亚单位疫苗，即疫苗包含自病原体纯化的抗原或其免疫原性片段，特别是重组抗原或其免疫原性片段。在仍进ー步实施方式中，疫苗是基于灭活的全病原体细胞或细胞级分的疫苗。分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞优选是牛分枝杆菌(M.bovis)细胞，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)细胞，特别是减毒的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)细胞或其他分枝杆菌属(Mycobacterium),例如田鼠分枝杆菌(M.microti),耻垢分枝杆菌(M.smegmatis),卡耐提分枝杆菌(M.canettii ),海分枝杆菌(M.marinum)或偶发分枝杆菌(M.fortuitum)。更优选地,细胞是重组牛分枝杆菌(M.bovis) (BCG)细胞,特别是来自丹麦亚型布拉格株的重组牛分枝杆菌(M.bovis)细胞(43)。在尤其优选的实施方式中，疫苗是重组脲酶-缺陷型分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞。在尤其优选的实施方式中，将分枝杆菌属(Mycobacterium)细胞的ureC序列灭活(A Urec),例如通过构建含有被选择标记物基因破坏的ureC基因的自杀载体，用所述载体转化靶细胞及筛选具有脲酶阴性表型的选择标记物-阳性细胞。最优选，细胞是表征为rBCGAUrec::Hly+::Hyg+的重组BCG株丹麦亚型布拉格。能引发免`疫应答的结构域优选选自来自牛分枝杆菌(M.bovis)或结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的免疫原性肽或多肽或选自具有至少6个,优选至少8个氨基酸，更优选至少9个氨基酸和例如达20个氨基酸长度的其免疫原性片段。适合的抗原的特定例是自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的Ag85B (p30),自牛分枝杆菌(M.bovis) BCG的Ag85B (a-抗原)，自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的Ag85A及自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的 ESAT-6 及其片段。疫苗优选是针对分枝杆菌感染，特别是肺部分枝杆菌感染，更特别是结核的疫苗。根据本专利技术的方法，測定免疫接种的受试者中的Thl7免疫应答。受试者优选是哺乳动物，例如人。測定优选在源于所述受试者的生物学样品中实施，其中所述样品包含免疫细胞，特别是T细胞和/或NK细胞，更特别是抗原-特异性T细胞诸如CD4T细胞。样品可为体液或组织样品，例如血，血清或血浆样品或自肺或脾脏的样品。收集样品的方法为本领域所熟知。本专利技术的方法需要确定Thl7免疫应答。为此目的，优选用免疫原再刺激待分析的受试者的样品中存在的免疫细胞及测定从所述细胞的细胞因子表达。待分析的细胞优选是抗原-特异性T细胞，更优选CD4T细胞。用于再刺激的免疫原对应于疫苗中存在的免疫原(待测定其功效)。免疫原可以与疫苗中存在的形式相同的形式或以不同形式存在。例如，当疫苗包含免疫原性多肽时，在再刺激步骤中免疫原可包含其免疫原性片段或反之亦然。优选地，用于再刺激步骤的免疫原是纯化的多肽或肽。为了测试结核疫苗的功效，特别是上述活结核疫苗，免疫原可有利地为分枝杆菌抗原，例如自PPD"纯化的蛋白衍本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·德塞尔，S·H·E·考夫曼，S·班德曼，L·格罗德，
申请(专利权)人：马普科技促进协会，疫苗项目管理有限公司，
类型：
国别省市：