碱基经修饰的寡核苷酸制造技术

技术编号:9521245 阅读:84 留言:0更新日期:2014-01-01 18:40
本发明专利技术涉及用于增强结合亲和力的具有碱基经修饰的核苷的寡核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及用于增强结合亲和力的具有碱基经修饰的核苷的寡核苷酸。【专利说明】碱基经修饰的寡核苷酸本申请要求2010年11月5日提交的美国临时申请61/410,672的优先权,将其全部内容并入本文作为参考。
本专利技术涉及与互补的多核苷酸具有增强的结合亲和力的经修饰的寡核苷酸。
技术介绍
微RNA(miR)牵涉在包括心脏功能的调节和维持在内的多种生物学过程中(VanRooij et al./iMicroRNAs:Powerful New Regulators of Heart Disease and ProactiveTherapeutic Targets, ^J.Clin.1nvest.117(9):2369-2376(2007) ;Chien KR,“MolecularMedicine:MicroRNAs and the Tell-tale Heart,,^Nature447:389-390 (2007))。因此,miR代表用于病症包括如心脏肥大、心肌梗塞、心力衰竭、血管损伤和病理性心脏纤维化等的一类相对新型的治疗靶标。miR是长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白质编码RNA,并通过促进它们的降解而充当靶标mRNA的阻抑物(此时它们的序列完全互补),或者通过抑制翻译而充当靶标mRNA的阻抑物(此时它们的序列含有错配)。机制包括将成熟miRNA链结合至RNA诱导性沉默复合物(RISC)中,在那里它通过碱基对互补性与它的靶标RNA联入口 οmiRNA功能可通过反义多核苷酸或者通过模拟miRNA功能(“miRNA模拟”)的多核苷酸而进行治疗靶向。然而,在治疗上用基于寡核苷酸的药物靶向miRNA遇到数个挑战,包括RNA-结合亲和力和 特异性、细胞摄取的效力和核酸酶抗性。例如,当将多核苷酸引入完整细胞中时,它们被核酸酶攻击并降解,导致活性损失。尽管已经制备了多核苷酸类似物以试图避免它们的降解(例如,通过2’取代)(Sproat et al., Nucleic AcidsResearchl7:3373-3386 (1989)),但是所述修饰经常影响多核苷酸的预期生物作用的效力。这种降低的效力在各种情况中可能是由于经修饰的多核苷酸不能与靶标RNA形成稳定双链体和/或由于与细胞机构(cellular machinery)的相互作用的损失。其它修饰包括使用锁定的核酸,其具有改善RNA-结合亲和力的潜力(Veedu et al., “Locked Nucleic Acidas a Novel Class of Therapeutic Agent, ” RNA Biology6:3,321-323(2009))。用于miRNA抑制剂的寡核苷酸化学模式或者修饰具有改善抑制剂的递送、稳定性、效力、特异性,和/或毒性分布的潜力,并因此在治疗背景中为有效靶向miRNA功能所需要的。
技术实现思路
本专利技术涉及寡核苷酸,所述寡核苷酸包含至少一个具有2’修饰的核苷酸和至少一个具有氨基羰基修饰的碱基的核苷酸,以及涉及包含所述经修饰的寡核苷酸的药物组合物,和使用和合成这些寡核苷酸的方法。在一个方面,本专利技术提供寡核苷酸,其包含至少一个具有2’修饰的核苷酸和至少一个具有氨基羰基修饰的碱基的核苷酸。在多个实施方案中,所述寡核苷酸提供的优点中包括在双链体结合亲和力方面中的优点,例如在RNA敲低中的效力。在一些实施方案中,所述寡核苷酸包含与人miRNA的核苷酸序列至少基本互补的核苷酸序列。在其它实施方案中,所述寡核苷酸至少基本上与非miRNA的哺乳动物转录体(transcript)互补,并因此可用于基因表达的反义抑制。在其它实施方案中,所述寡核苷酸包含人miRNA序列,并因此模拟miRNA功能。在其它实施方案中,所述寡核苷酸是使用任何常规平台体外检测或者量化样品中的核酸的检测探针。 碱基修饰为氨基羰基,例如甲酰氨基(carboxamino)、氨基甲酰基(carbamoyl)或者碳酰胺(carbamide)基团。在各个实施方案中的修饰位于嘧啶碱基的C_5位或者嘌呤碱基的C-8位。本专利技术寡核苷酸的修饰用氨基羰基含有基团或者取代基,非限制性地,所述基团或者取代基可为C1-C18烷基、C1-C18烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基,和-(CH2) ^NR1R2,其中η为1-6的整数以及R1和R2独立地为H或者C1-C6烷基。示例性部分包括哌啶、哌嗪、吗啉代、或者咪唑,所述示例性部分中的每个可为取代的或者未取代的。在其它实施方案中,所述取代基为C4-C20烷基或者烯基、苯基,或者胺基团。所述寡核苷酸还包含至少一个具有2 ’修饰的核苷酸。在一些实施方案中,所述2 ’修饰可独立地选自C1-6烷基、2’ O-烷基(C1-C6)、F、Cl、NH2, CN,或者SH。其它潜在的2’修饰描述在本申请的其它部分中。示例性2’修饰为2’ Ο-Me,其可与碱基修饰一起提供寡核苷酸的Tm的协同增加。在其它实施方案中,至少一个核苷酸具有2’修饰,其为将糖锁定为C3内向构型的2’ -4’桥。未经修饰的2’位置可为氢。具有经修饰的碱基的核苷酸的数目可发生变化,但是在某些实施方案中为至少25%的核苷酸,或者至少50%的核苷酸,或者至少75%的核苷酸或者100%的核苷酸。在一些实施方案中,所述Tm的增加可用相对少的碱基经修饰的核苷酸如少于50%的核苷酸或者少于25%的核苷酸来实现。在一些实施方案中,所述寡核苷酸仅含有1、2、3或者4个碱基经修饰的核苷酸。在这些实施方案中,碱基经修饰的核苷酸可为嘧啶碱基如尿苷或者胸腺嘧啶,和/或可含有2’修饰如2’ O’ Me0即,寡核苷酸(例如,具有约16个核苷酸)可单一结合具有碱基修饰和2’OMe修饰的核苷酸,未修饰的2’位置为氢,或者可选择地,独立选自LNA。在某些实施方案中,所述寡核苷酸还包含骨架化学如帽修饰(capmodifications)和硫代憐酸酯连接物(phosphorothioate linkages)。本专利技术包括以下发现:当结合至反义寡核苷酸中时,新的碱基经修饰的2’ -OMe-嘧啶显示出与它们互补序列的双链体增强的结合亲和力。另外,这些具有硫代磷酸酯骨架修饰的嘧啶碱基经修饰的2’ -OMe核苷酸在细胞培养中显示出抗它们的微RNA靶标序列的生物学活性,甚至在不使用转染试剂的情况下也是如此。本申请通过使用在心脏组织中显示靶标miRNA敲低的体内系统模型也证实了体内活性。在另一方面中,本专利技术提供了减少或者抑制细胞中RNA表达或者活性的方法、预防或者治疗受试者中的与RNA或者其表达相关或者由RNA或者其表达介导的病症的方法、使用本申请所述的碱基经修饰的寡核苷酸的方法。【专利附图】【附图说明】图1是表,所述表显示针对2,-OMe-尿苷寡核苷酸的各种碱基修饰物的Tm增强量。碱基修饰是在C5处的甲酰氨基连接物。图2显示出用于结合至寡核苷酸中的经修饰的单体核苷和相应的亚磷酰胺的合成。图3说明通过图2中的方案合成的亲水和疏水核苷修饰物,并显示在寡核苷酸中的一些示例性结合模式。图4将数个碱基修饰的Tm测量值相对于LNA/DNA、2’_0Me硫代磷酸酯和DNA寡核苷酸进行比较。所显示的为碱基修饰模式。图5是当与未修饰的m本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:K瓦格勒C达尔比WS马歇尔
申请(专利权)人:米拉根医疗公司
类型:
国别省市:

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