果汁中嗜酸耐热菌的检测方法及其诱导剂、显色剂技术

本发明专利技术涉及一种果汁中嗜酸耐热菌的检测方法及其诱导剂、显色剂。涉及的方法包括诱导培养和显色检测，其中诱导培养是利用诱导剂对待检测果汁样品进行诱导培养；显色检测是利用显色剂与经诱导培养后的待检测果汁样品进行显色反应，经显色反应后的反应体系中出现琥珀色化合物，说明待检测果汁样品中含有嗜酸耐热菌。涉及的诱导剂包括香草酸和培养基。涉及的显色剂包括具有辣根过氧化物酶活性催化活性的DNA酶和双氧水。本发明专利技术提出的基于DNA酶的快速比色检测方法，通过构建基于DNA酶的生物传感的技术，实现对该菌现场快速的定性和定量检测，具有较高的灵敏性和特异性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种果汁中嗜酸耐热菌的检测方法及其诱导剂、显色剂。涉及的方法包括诱导培养和显色检测，其中诱导培养是利用诱导剂对待检测果汁样品进行诱导培养；显色检测是利用显色剂与经诱导培养后的待检测果汁样品进行显色反应，经显色反应后的反应体系中出现琥珀色化合物，说明待检测果汁样品中含有嗜酸耐热菌。涉及的诱导剂包括香草酸和培养基。涉及的显色剂包括具有辣根过氧化物酶活性催化活性的DNA酶和双氧水。本专利技术提出的基于DNA酶的快速比色检测方法，通过构建基于DNA酶的生物传感的技术，实现对该菌现场快速的定性和定量检测，具有较高的灵敏性和特异性。【专利说明】果汁中嗜酸耐热菌的检测方法及其诱导剂、显色剂
本专利技术涉及果汁中有害微生物的检测技术，具体涉及用于检测果汁中嗜酸耐热菌的诱导剂、显色剂及其应用。
技术介绍
嗜酸耐热菌是一种嗜酸、嗜热、好氧的芽孢杆菌，是耐热菌中主要的果汁污染菌，其芽孢能够经受酸性果汁加工中的巴氏灭菌而存活，当其在条件适宜的时候，又可大量繁殖，引起果汁感官和品质劣变。该菌主要污染苹果汁、橙汁等浓缩果汁及果汁饮料，产生不良风味物质，致使果汁腐败变质，可导致生产上的经济损失。目前，果汁中嗜酸耐热菌检测方法主要有利用细菌培养而达到不同微生物之间被分离的培养基分离鉴定，根据不同微生物之间的DNA和RNA序列不同产生的分子生物学检测方法(如PCR技术、RT-PCR方法)，依据过氧化物酶催化化学反应带来的辣根过氧化物酶(HRP)检测方法，还有依靠高端仪器检测分离技术的红外光谱检测等。在上述现有的嗜酸耐热菌检测技术中，应用较多的是细菌分离培养和生化鉴定的方法，但该方法存在检测指标多、操作复杂、耗时、检测结果滞后等缺点，导致在果汁生产过程中不能及时反馈果汁的污染状况而采取相应防措施。此外，依靠像红外光谱检测一类的传统仪器检测具有检测灵敏高，检测结果稳定性好等优点，但是大型仪器设备昂贵、需要具备相关知识的专业技术操作人员、存在检测成本高昂、检测结果较慢等缺点，极大限制了大型仪器设备的大规模应用于现场快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种果汁中嗜酸耐热菌的检测方法，以解决现有的检测方法存在的检测速率低、特异性差和成本高的问题。为此，本专利技术提供的果汁中嗜酸耐热菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:诱导培养:利用诱导剂对待检测果汁样品进行诱导培养；所述诱导剂包括香草酸和培养基，所述培养基为402培养基、YSG培养基、BSSA培养基、BAT培养基或K氏培养基。显色检测:利用显色剂与经诱导培养后的待检测果汁样品进行显色反应，经显色反应后的反应体系中出现琥珀色化合物，说明待检测果汁样品中含有嗜酸耐热菌；所述显色剂包括DNA酶和双氧水。所述香草酸和培养基的用量为:1毫升待检测果汁样品需使用0.1?0.17克的香草酸和100毫升培养基。 所述DNA酶包括单链核酸序列5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’、氯化血红素、氯化钾或氯化铵、氯化钠、PH为5的醋酸钠-醋酸缓冲液。所述双氧水用量为:4mM双氧水:50 μ L,所述DNA酶的组份为:0.3 μ M 单链核酸序列 5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’:50μ L ；I μ M氯化血红素:50 μ L ;20mM 氯化钾溶液:100 μ L ;150mM 氯化钠溶液:100 μ L ;pH为5的醋酸钠-醋酸缓冲液:600 μ L。所述诱导培养的条件为:20?60°C，培养13?15个小时。所述显色检测的条件为:20?30°C、15?45分钟。所述待检测果汁样品中的糖度为8?12° Brix。进一步，本专利技术提供的果汁中嗜酸耐热菌的检测方法包括以下步骤:( I)制作嗜酸耐热菌浓度与紫外吸收强度之间的标准曲线:(2)测定待检测果汁样品中嗜酸耐热菌的含量:包括利用上述诱导剂对待检测果汁样品进行诱导培养，利用上述显色剂与经诱导培养后的待检测果汁样品进行显色反应，检测显色反应体系的紫外吸收值，和，从标准曲线上读取待检测果汁样品中嗜酸耐热菌的含量。本专利技术的又一目的在于提供一种用于检测果汁中检测嗜酸耐热菌的诱导剂，该诱导剂为上述几种诱导剂中的一种。本专利技术的又一目的之一在于提供一种用于检测果汁中检测嗜酸耐热菌的显色剂，该显色剂为上述几种显色剂的一种。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下:本专利技术提出的基于DNA酶(DNAzyme)的快速比色检测方法，通过构建基于DNA酶(DNAzyme)的生物传感的技术，实现对该菌现场快速的定性和定量检测，具有较高的灵敏性和特异性。【专利附图】【附图说明】图1为不同菌浓度样品诱导反应时愈创木酚的代谢曲线；图2为实施例2中不同菌浓度对应的显色反应结果；图3为实施例2中不同菌浓度菌对应的显色反应体系的吸光度图谱；图4为实施例2的标准曲线。【具体实施方式】本专利技术所述的DNA酶是指能够在酸性条件下，催化过氧化氢氧化愈创木酚产生琥珀色化合物四聚愈创木酚的一种酶。本专利技术所用的单链核酸序列5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’可以形成G四分体结构，在氯化钾存在条件下，这种G四分体可以结合氯化血红素形成DNA酶(DNAzyme)。该酶可以催化双氧水和愈创木酚之间的化学反应。本专利技术所使用的培养基具体可选用402培养基、YSG培养基、BSSA培养基、BAT培养基、K氏培养基等可用于培养嗜酸耐热菌培养的培养基。其中固体培养基用于菌计数，液体培养基则用于菌的培养代谢。其中402培养基的配方如下:二水合氯化钙0.25g、七水硫酸镁0.50g、硫酸铵0.20g、磷酸二氢钾3.00g、酵母浸提物2.00g、葡萄糖5.0Og ;七水硫酸锌0.10g、四水氯化锰0.03g、硼酸0.30g、六水氯化亚钴0.20g、二水氯化铜0.01g、六水合氯化镍0.02g、钥酸钠0.03g ;无菌水IOOOmL ；已知在添加有香草酸的培养基中，嗜酸耐热菌可以利用香草酸进行自身代谢活动，产生愈创木酚。酸性条件下，过氧化氢在DNAzyme的催化作用下氧化愈创木酚产生琥珀色化合物四聚愈创木酚。该琥珀色化合物四聚愈创木酚可用肉眼观察，具体通过与空白对照管(空白对照为未添加香草酸导致最终没有愈创木酚生成)观察琥珀色。且该琥珀色化合物四聚愈创木酚在波长为420nm处具有较强的紫外可见光吸收峰，且其含量不同紫外吸收强度也不同。由此，可通过将含有嗜酸耐热菌的果汁样品在适当条件下培养后进行显色反应，接着判断反应体系是否产生琥珀色化合物来实现对嗜酸耐热菌的定量检测。专利技术人基于到上述机理，利用DNAzyme技术对果汁中的嗜酸耐热菌进行快速检测。首先，本专利技术人考虑如何才能诱导果汁中的嗜酸耐热菌产生愈创木酚，设计了不同添加量的香草酸作为诱导剂，促使果汁中的嗜酸耐热菌在培养中能够产生愈创木酚而被DNA酶检测。专利技术人发现当香草酸添加量小于0.1克(每100毫升培养基中)时，嗜酸耐热菌能生长繁殖但是没有愈创木酚产生，得出小于0.1克(每100毫升培养基中)的香草酸不能作为诱导剂添加量被使用；当香草酸添加量大于0.17克(每100毫升培养基中)时，嗜酸耐热菌不能生长繁殖也不能产生愈创木酚，得出大于0.17克(每100毫升培养基中)的香草酸也不能作为诱导剂添加量被使用；当香本文档来自技高网...

【技术保护点】
果汁中嗜酸耐热菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：诱导培养：利用诱导剂对待检测果汁样品进行诱导培养；所述诱导剂包括香草酸和培养基，所述培养基为402培养基、YSG培养基、BSSA培养基、BAT培养基或K氏培养基。显色检测：利用显色剂与经诱导培养后的待检测果汁样品进行显色反应，当反应体系中出现琥珀色化合物时说明待检测果汁样品中含有嗜酸耐热菌；所述显色剂包括DNA酶和双氧水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王建龙，刘涛，岳田利，袁亚红，李忠宏，张道宏，刘伟，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：