一种用于检测猪流感病毒的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测猪流感病毒的试剂盒及其应用。所述试剂盒可用于猪流感病毒H1N1、H3N2、H1N2亚型的检测。该试剂盒可在60℃-65℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到猪流感病毒，能较好满足目前对猪流感病毒现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、食品卫生部门、畜牧饲养场等的现场检测，易于大范围推广应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种用于检测猪流感病毒的试剂盒及其应用。所述试剂盒可用于猪流感病毒H1N1、H3N2、H1N2亚型的检测。该试剂盒可在60℃-65℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到猪流感病毒，能较好满足目前对猪流感病毒现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、食品卫生部门、畜牧饲养场等的现场检测，易于大范围推广应用。【专利说明】—种用于检测猪流感病毒的试剂盒及其应用
本专利技术属于动物卫生检验
，特别是一种能够检测H1N1、H3N2、H1N2亚型猪流感病毒的LAMP引物组及制备的试剂盒。
技术介绍
猪流感(SwineInfluenza，SI)是由猪流感病毒(Swine Influenza Virus , SIV)引起的一种急性、高度接触传染性的群发性呼吸道疾病，临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难为特征。20世纪90年代中期,猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory diseasecomplex, PRDC)的发生和流行使得猪流感的危害更加突出。此外，由于猪是流感病毒基因重组或重配的“混合器”，是禽与人流感病毒基因重配的重要场所，因此该病还具有重要的公共卫生意义。目前国内外报道的猪流感实验室诊断方法很多，在病原学诊断方法中主要有病原分离鉴定和RT-PCR等方法。2000年Notomi等首次报道环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)。该技术是一种新颖的核酸扩增方法,其特点是针对革巴基因的6个区域设计特异性引物，在等温条件下(60~65°C)利用Bst链置换DNA聚合酶，高效、快速、特异性扩增靶序列。LAMP方法I h左右即可完成核酸扩增反应，其扩增效率可达到IO9~IOltl个数量级，与传统PCR技术相比，该方法具有操作简单，快速灵敏，不需要特殊的仪器设备等优点。目前，该方法在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有相关论文报道。Enomoto及Kaneko等分别采用LAMP和聚合酶链反应(PCR)两种方法对与伪狂犬病毒 同属的7型人类疱疹病毒进行DNA扩增，测得LAMP反应的灵敏性为每管250拷贝，较PCR的敏感性高10倍。wamodo等根据gyrB基因序列针对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的特异引物和16S核糖体RNA保守序列的分枝杆菌属公共引物，用LAMP方法从痰标本中鉴定结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，可检测到10个拷贝的细菌。在反应试管中加入SYBR Green I进行检测。如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。本专利依据LAMP技术的原理，针对猪流感病毒NP基因保守序列，通过各种条件的优化和筛选，设计出I组引物，可用于样品中猪流感病毒的检测。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于检测猪流感病毒的LAMP特异性引物组，其特征在于: SIV-F3 GTCTCAAGGCACCAAACGSEQ ID NO: I SIV-B3 AAAAGCAGAGAGCACCATSEQ ID NO:2 SIV-FIP ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACT SEQ ID NO:3SIV-BIP GGTGGAATCGGAAGATTCTACATCTTTTTGCTATTTTGAATTAATCGTCCCTSEQ ID NO:4 (I)它是针对猪流感病毒NP基因的保守区域设计的。(2 )可检测出HlNl、H3N2、H1N2亚型的猪流感病毒。本专利技术的另一个目的是提供含有上述引物组的试剂盒。所述的试剂盒包括: (1)LAMP反应液:每 22 μ L LAMP 反应液中含有:2 XBuffer(含 Mg2+) 2.5 μ L ；SIV-F3 0.5 μ L ； SIV-B30.5 μ L ；SIV-FIP 4 μ L ；SIV-BIP 4 μ L ；dNTPs 3.5μ L ；/jC 7μ L(2)8U/y L Bst 酶 (3)用于检测猪流感病毒的LAMP特异性引物组，其中的引物指的是: SIV-F3 GTCTCAAGGCACCAAACG SEQ ID NO: I SIV-B3 AAAAGCAGAGAGCACCATSEQ ID NO:2SIV-FIP ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACTSEQ ID NO:3SIV-BIP GGTGGAATCGGAAGATTCTACATCTTTTTGCTATTTTGAATTAATCGTCCCTSEQ ID NO:4o本专利技术所述用于检测猪流感病毒的试剂盒的制备方法，其特征是包括下述步骤: (1)扩增反应体系:在LAMP反应体系中加入样品CDNA模板2μ L，Bst酶I μ L (2)扩增反应过程:在DNA循环仪上95°C条件下变性5min，在63 °C进行60min，并且在80°C持续2min，4°C，保存； (3)扩增反应结束，取扩增产物5μ Li μ L进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果确定检测样品是否含有猪流感病毒； (4)反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和条带现象，如果电泳后出现特征性“梯状”条带，则说明样品中还有猪流感病毒。如果电泳结果未见特征性“梯状”电泳带，表明样品中不含有猪流感病毒。本专利技术公开的用于检测猪流感病毒的试剂盒与现有技术相比所具有的积极效果在于: (I)本专利技术在一定程度上提供了我国该病毒检测能力提高的技术支撑和理论依据。此外，基于LAMP方法的特异性和敏感性高，成本低廉，易于操作等诸多优势，为猪流感病毒的实时快速检测和出入境检疫提供新技术来源，对于及时监控该病的发生发展，制定行之有效的防制措施，对提高我国猪流感病毒免疫防制水平具有重要意义。(2)由于猪流感病毒有多个血清型，广泛流行于猪群中的主要有H1N1、H1N2和H3N2型，单纯检测出一种血清型的猪流感病毒会导致误诊。本专利技术的用于检测猪流感病毒的试剂盒可同时检测出这些血清型的猪流感病毒，适用于临床病例、病料、细胞培养物等样品的检测。【专利附图】【附图说明】图1为LAMP试验电泳图；自左向右，依次为1，猪流感病毒；2，空白对照；M，IOObpDNA marker ；图2为试剂盒检测临床样品电泳图；自左向右，依次为1，空白对照；2至14临床样品；15,阳性对照;M, IOObp DNA marker ； 图3为特异性试验电泳图；自左向右，依次为1，猪瘟病毒；2，猪伪狂犬病毒；3，猪蓝耳病病毒；4，猪细小病毒；5，猪圆环病毒；6，猪流感病毒TJl株；7，猪流感病毒TJ3株；8，猪流感病毒TJlO株；9，类禽猪流感病毒抗原；10，空白对照；M，250bp DNA marker。【具体实施方式】为了更充分地解释本专利技术的实施方法，提供了用于检测猪流感病毒的LAMP引物组的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本专利技术的范围。其中所用的试剂原料均有市售。本专利技术所述的猪流感病毒引物组序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测猪流感病毒的LAMP特异性引物组，其特征在于：SIV?F3?GTCTCAAGGCACCAAACG???????SEQ?ID?NO：1?SIV?B3?AAAAGCAGAGAGCACCAT???????SEQ?ID?NO：2?SIV?FIP?ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACTSEQ?ID?NO：3?SIV?BIP?GGTGGAATCGGAAGATTCTACATCTTTTTGCTATTTTGAATTAATCGTCCCTSEQ?ID?NO：4。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：鄢明华，张莉，李秀丽，孙英峰，韩伟，路超，任卫科，王利丽，池晶晶，李富强，杨春蕾，
申请(专利权)人：天津市畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：