一种实时荧光RT-PCR检测冠状病毒的试剂盒及其应用，属于基因检测领域。本发明专利技术的试剂盒灵敏度和特异性非常高。通过本发明专利技术试剂盒实现了对痰液、鼻咽拭子等样品中的冠状病毒的快速早期检测和定量分析。本发明专利技术检测周期短、效率高；检测病毒特异性强，准确率高；病毒定性分析的同时还能定量分析；可检测出的病毒的最低浓度为1.0×102copies/mL，灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种实时荧光RT-PCR检测冠状病毒的试剂盒及其应用，属于基因检测领域。本专利技术的试剂盒灵敏度和特异性非常高。通过本专利技术试剂盒实现了对痰液、鼻咽拭子等样品中的冠状病毒的快速早期检测和定量分析。本专利技术检测周期短、效率高；检测病毒特异性强，准确率高；病毒定性分析的同时还能定量分析；可检测出的病毒的最低浓度为1.0×102copies/mL，灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。【专利说明】—种实时荧光RT-PCR检测冠状病毒的试剂盒及其应用
本专利技术属于基因检测领域，涉及一种实时荧光RT-PCR检测冠状病毒的试剂盒及其应用。本专利技术的试剂盒中包含有筛选获得的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，本专利技术试剂盒具有早期、快速、灵敏、特异的特点，还可用于冠状病毒的定量分析。
技术介绍
冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体，最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60-200nm,平均直径为IOOnm,呈球形或椭圆形,具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。已知有两种冠状病毒会影响人类，是0C43株和229E株。其中2/3早产儿的普通感冒与呼吸道感染是由这两种病毒所引起。目前所知，冠状病毒科只感染脊椎动物，与人和动物的许多疾病有关。这类病毒具有胃肠道、呼吸道和神经系统的嗜性。冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一，在儿童可以引起上呼吸道感染，一般冠状病毒很少波及下呼吸道。冠状病毒感染的潜伏期一般为2至5天，平均为3天。典型的冠状病毒感染呈流涕、不适等感冒症状。不同型别病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同，0C43株引起的症状一般比229E病毒严重。有报道冠状病毒感染可以出现发热、寒战、呕吐等症状。病程一般在I个星期左右，临床过程轻微，没有后遗症。冠状病毒还可以引起婴儿、新生儿急性肠胃炎，主要症状是水样大便、发热、呕吐，每天10余次，严重者可以出现血水样便。冠状病毒通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷气、接触传染。临床上，多数冠状病毒引起轻度和自愈性疾病,但少数可有神经系统并发症。常用的检测冠状病毒感染的方法主要有四种:(I)组织培养病毒分离:从鼻咽分泌物及咽拭子中分离病毒接种于原代人胚肾细胞、人胚肺成纤维细胞或猴肾细胞及HeLa细胞等，经培养2~3d后用中和抗体做中和试验和空斑形成试验，进行特异的血清型鉴定。(2)血清学检测:包括补体结合试验、血凝抑制试验、间接免疫荧光及酶联免疫试验等，但由于缺乏合适的交叉反应抗原以覆盖众多CoV血清型，使得这些方法的应用受到很大限制。(3)分子生物学检测:近来RT-PCR的方法已广泛用于CoV的检测，其对CoV检测较组织培养更敏感更快捷。(4)荧光定量PCR技术(FQ-PCR)是近年来发展起来的一种快速直接的核酸的检测技术。荧光定量PCR技术是在普通PCR的基础上发展起来的实时核算定量检测技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光定量PCR技术的一种也称为逆转录实时PCR，这是一种直接快速检测RNA的方法，它与荧光定量PCR技术的不同之处是多加了逆转录酶，同时多加了一个逆转录反应的步骤。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种荧光实时RT-PCR检测试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术早期、快速、灵敏、特异诊断冠状病毒感染的试剂盒。本试剂盒检测的基本原理是利用一对特异性的寡核苷酸引物和一条特异性寡聚核苷酸探针，在逆转录酶、耐热DNA聚合酶、高品质的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、RNA酶抑制剂以及Mg2+等RT-PCR反应缓冲液，通过荧光PCR扩增仪实现靶核苷酸的扩增，从而实现分别快速、高效、特异、实时定量检测冠状病毒寡核苷酸的目的。为了高效、特异、灵敏的检测出冠状病毒，本专利技术在对GeneBank中所有的现有的冠状病毒基因序列进行生物信息学分析，找出了冠状病毒的特异性保守区，并对这个保守区域设计了多对引物、探针。通过对冠状病毒标准株的检测，筛选出灵敏度高、特异性好、且针对冠状病毒的一对引物(用于扩增冠状病毒靶多核苷酸)和一条探针，即:能与双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物CoV-F、能与双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物CoV-R、能与靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有突光报告集团和突光粹灭集团的寡核苷酸探针CoV-P,其中突光报告基团任选自FAM、TET、JOE、HEX、VIC ;荧光猝灭基团任选自:TAMRA、DABCYL, BHQ。其中:正向引物CoV-F 的序列为:5’-GGGAAGGCCAGGACTTAAGC-3’ (SEQ ID NO: I)；反向引物 CoV-R 的序列为:5 ’-CGGTTAAGAGCTTCCGTACT-3’ (SEQ ID NO:2);寡核苷酸探针CoV-P 的序列为:5’-GGCTAAAGGCTTGGATTAGCCATT-3’ (SEQ ID NO:3)，优选的，该寡核苷酸探针5’端连接有FAM (5’羧基荧光素)，3’端连接有TAMRA (N，N，N’，N’ -四甲基_6_羧基罗丹明)。本专利技术提供了一种用于检测冠状病毒的寡核苷酸组合物，所述组合物包含1)-4)中任一个:I)寡核苷酸正向引物CoV-F ;2)寡核苷酸反向引物CoV-R ;3)寡核苷酸探针CoV-P ；4) I)-3)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85%的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。本专利技术还提供了上述寡核苷酸组合物在制备检测冠状病毒的试剂中的应用，其中所述试剂为用于实时荧光PCR的试剂。本专利技术的目的之一是提供一种冠状病毒的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含I)~4)中任一个:I)能与冠状病毒双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物CoV-F ；2)能与冠状病毒双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物CoV-R ；3)能与冠状病毒靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针CoV-P ;4) I)~3)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85%的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。本专利技术的目的之一是提供一种冠状病毒的实时荧光PCR检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种冠状病毒的RT?PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：RNA提取试剂，RT?PCR扩增反应液，阴性质控品，阳性质控品，冠状病毒阳性标准品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：石康，江城名，朱世新，
申请(专利权)人：湖北朗德医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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