本发明专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及淡水经济甲壳动物青虾EST微卫星标记（EST-SSR）的筛选和应用。可以利用该EST-SSR标记技术研究青虾选育群体的遗传特征和群体结构，实现分子标记在青虾育种中的初步应用，为构建高密度青虾遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及淡水经济甲壳动物青虾EST微卫星标记（EST-SSR）的筛选和应用。可以利用该EST-SSR标记技术研究青虾选育群体的遗传特征和群体结构，实现分子标记在青虾育种中的初步应用，为构建高密度青虾遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。【专利说明】青虾EST-SSR分子标记的引物组、标记方法及应用
本专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及淡水经济甲壳动物青虫下(曰本沼虫下，應EST (expressed sequence tags, ESTs)微卫星标记(EST-SSR)的筛选和应用。
技术介绍
青奸，学名日本沼奸iMacrobrachium nipponense),隶属十足目(Decapoda),长臂虫下科(Palaemonidae)、沼奸属(Macrobrachium),广泛分布于中国、日本、韩国、越南、緬甸等亚洲国家，具有营养价值高、生长快、适应能力强等特点，深受广大消费者的欢迎，是重要的经济养殖虾类。我国目前有18个省市(区)进行青虾养殖，其养殖面积居淡水虾类第一位。《中国渔业年鉴》2011年统计数据显示，青虾在我国养殖年产量约23.02万吨，养殖年产值超过100亿元。但目前养殖的青虾大多数为未经系统遗传选育的野生种在池塘多代养殖的后代，随着青虾养殖业的高速增长，集约化程度的不断提高，近年来出现了严重的品种退化现象，严重制约了青虾养殖业的发展。要实现青虾养殖的可持续发展，必须对青虾进行遗传改良。目前，国内渔业遗传改良方法主要以群体选育为主。采用该种方法得到的后代个体亲缘关系不明，因此需要更精确的分子水平方法辅助进行有效鉴别，从而能建立选育群体的谱系，有效减少近交，即分子标记辅助育种方法。EST是短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一部分。近年来，大量数据库中EST数量迅速增长，其中大量EST中含有微卫星序列(microsatellite,又叫simplesequence repeats, SSR),为EST-SSR标记的开发提供了丰富的序列资源。由于EST-SSR标记开发是基于基因组中的表达序列，与普通基因组微卫星标记(genomic-SSR，gSSR)相比具有信息量大、通用性好、开发简单快捷、费用低等优点，更重要的是，该标记能直接和功能基因相关，在分子标记辅助育种的相关研究如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分尚和鉴定新基因等中都有极闻的应用价值。目前青虾EST数据库中包含大量EST序列，已有报道从这些序列中克隆得到多个性别、生殖、发育等相关基因，而从青虾EST文库中筛选多态微卫星标记的方法至今没有报道。
技术实现思路
本专利技术利用生物学信息学方法从青奸促雄腺转录组文库(http://www.ffrc.cn/gene/list, asp)中搜索EST微卫星序列，并筛选具有多态的微卫星引物，找到青虾EST-SSR标记的特异引物，为青虾的青虾群体遗传多样性分析提供可用的分子标记。进一步可以利用该EST-SSR标记技术研究青奸选育群体的遗传特征和群体结构,实现分子标记在青奸育种中的初步应用，为构建高密度青虾遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。具体的技术方案是: 一种青虾EST-SSR分子标记的引物组，其特征在于，包括有如下3个位点所对应的正向和反向引物:EWXM33F: AACATTCACTGGCTCTTCG(SEQ ID N0.1)R: CCACTACTGTTTCTATCCACC(SEQ ID N0.2)EWXM62F:GCTTGTAGAAACCCGTAG(SEQ ID N0.3)R:CTCTGACCTGCTTAGAAAA(SEQ ID N0.4)EWXM147F:ATTGTCGTAGGCTCACGT(SEQ ID N0.5)R:AAAATTGGTCTTGCTCCC(SEQ ID N0.6) 本专利技术还提供了一种基于上述EST-SSR分子标记的引物组的青虾分子标记方法，包括如下步骤: 第I步、提取青奸样本的DNA ； 第2步、使用分子标记引物组对青虾样本进行PCR扩增； 第3步、对扩增产物进行电泳分析，利用电泳结果对青虾进行分类。上述的PCR扩增中，反应体系可以包括有:2.5mM dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)?μ?，IOXBuffer 2.5PL，25mM MgCl2 2μ?，8pmol/^L 的两侧引物各 0.75μ?，5 U Taq DNA 聚合酶0.2μ?, 50ng/^L的DNA模板2μ?，用超纯水补足至25μ?。上述的PCR扩增中，扩增程序可以是:94°C预变性5min ;94°C变性30s，Tm 30s,72°C 45s, 30个循环；最后72°C延伸7min;4°C保存；所述的Tm是指:SEQ ID N0.1~254°C、SEQ ID N0.1 ~2 52 °C、SEQ ID N0.5 ~6 50 °C。在PCR扩增结束后，可以对扩增结果使用电泳分析，来获得样品分类信息。电泳分析的参数可以是:采用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行检测，电压200V，电泳时间3~4小时，电压完毕后用染料染色10-15分钟。上述的EST-SSR分子标记的引物组可以在青虾群体遗传多样性分析中应用。有益效果 本专利技术的方法筛选得到了具有多态的微卫星引物，为利用EST-SSR标记技术研究青虾选育群体的遗传特征和群体结构，实现分子标记在青虾育种中的初步应用，为构建高密度青虾遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。【专利附图】【附图说明】图1.微卫星位点EWXM33在太湖群体中扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(Marker依次从上到下:234bp, 213bp, 192bp, 184bp, 124bp) 图2.微卫星位点EWXM62在太湖群体中扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(Marker依次从上到下:267bp, 234bp, 213bp, 192bp, 184bp, 124bp) 图3.微卫星位点EWXM147在太湖群体中扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(Marker依次从上到下:267bp, 234bp, 213bp, 192bp, 184bp)【具体实施方式】微卫星序列的筛选及多态性标记的确定 1.微卫星序列来源及筛选 青虾EST-SSR标记特异引物筛选方法包括以下步骤包括:从本课题组构建的青虾促雄腺转录组文库(http://www.ffrc.cn/gene/list.asp)中公布的青奸ESTs中，该文库序列全部为青虾的EST序列，来源于青虾促雄腺，采用微卫星序列检索软件SSR-hunter进行微卫星序列的查找，共采用70，702条EST序列，对于2~6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星序列进行分离。(按照微卫星筛选原则，最基本的原则是:对于2个及2个上碱基重复单元重复次数不低于5次，在此基础上，可按照自己经验和研究的需要，进一步改善或提高参数)。经过筛选，得到含有微卫星重复的ESTs共12，437条。接下来，再对这些ESTs序列进行聚类分析，采用DNAstar对这些微卫星ESTs进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种青虾EST?SSR分子标记的引物组，其特征在于，包括有如下3个位点所对应的正向和反向引物：EWXM33：SEQ?ID?NO.1～2；EWXM62：SEQ?ID?NO.3～4；EWXM147?：SEQ?ID?NO.5～6。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔慧，傅洪拓，周巧，龚永生，蒋速飞，熊贻伟，金舒博，张文宜，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：
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