提高植物转化效率的多个转化增强子序列的应用制造技术

本发明专利技术涉及提高农杆菌(Agrobacterium)和根瘤菌(Rhizobium)介导的植物细胞转化效率的方法和组合物，通过使用可操作地连接到包含T-DNA的重组构建体上的T-DNA边界序列上的附加转化增强子序列例如超驱动序列或者TSS序列可实现上述转化效率提高。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及提高农杆菌(Agrobacterium)和根瘤菌(Rhizobium)介导的植物细胞转化效率的方法和组合物，通过使用可操作地连接到包含T-DNA的重组构建体上的T-DNA边界序列上的附加转化增强子序列例如超驱动序列或者TSS序列可实现上述转化效率提高。【专利说明】提高植物转化效率的多个转化增强子序列的应用本申请是申请日为2007年07月18日和专利技术名称为“提高植物转化效率的多个转化增强子序列的应用”的200780034442.6号专利技术专利申请的分案申请。专利技术背景 本申请要求获得于2006年7月19日提交的美国临时专利申请60/831，814的优先权，其公开通过引用全文结合到本文中。1.专利
本专利技术主要涉及植物生物技术。更具体地说，本专利技术涉及提高细菌介导的植物转化效率的方法和组合物。2.相关技术描述在天然的农杆菌(Agrobacterium)介导的植物细胞的转化中，来自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒或者发根农杆菌(A.rhizogenes)的Ri质粒的一段DNA被转移到植物细胞中(例如Gelvin，2003)。该被转移的DNA (T-DNA)片段侧翼是不完全的24bp正向重复序列，该重复序列可被农杆菌核酸内切酶VirD2识别，通过在每一重复序列的一条链上的特定位点上形成切口而产生单链的T链。引发单链的T链形成的重复序列称为“右边界”(RB)，而终止单链的T链形成的重复序列被称为“左边界”(LB)。形成切口后，VirD2蛋白粘附在所述链的5’端，并引导T链进入植物细胞，在其他农杆菌和植物编码蛋白的帮助下T链被整合到植物基因组中。包含载体骨架序列在内的T-DNA区域的序列下游(从5’到3’方向)也可能被转移(例如Kononov等，1997)。这有可能是由于在转移到植物细胞之前农杆菌中至少一个边界不能形成缺口所致。通过比较多种农杆菌菌株的RB和LB序列，表明RB和LB享有共同的基序(Canaday等，1992)，这表明可能有其他元件参与RB加工效率的调节。邻近RB的顺式作用序列存在于许多农杆菌菌株中，包括根瘤农杆菌和发根农杆菌。这些序列对野生型侵入性而言是必需的(Veluthambi 等，1988 ；Shurvington 和 Reaml991 ；Toro 等，1989 ；Toro 等，1988 ；Hansen等，1992)。在根瘤农杆菌中该序列被Peralta等(1986)称为“超驱动(overdrive) ”或者“T-DNA传递增强子”。在发根农杆菌中该序列被Hansen等(1992)称为“T-DNA转移激活序列(TSS) ”。超驱动(“0D”)序列起始被定义为直接存在于章鱼碱Ti TL-DNA的RB重复序列之前的特定24bp基序(Peralta等，1986)。类似的序列存在于章鱼碱Ti TR-DNA的RB重复序列之前，并且也存在于胭脂碱Ti RB和农杆碱Ri TL右边界之前(Peralta等，1986、Shaw等，1984、Barker等，1983、Slighton等，1985)。进一步比较不同根瘤农杆菌显示8bp的超驱动核心序列存在于所有右边界序列之前，那些菌株包括胭脂碱菌株pTiT37、章鱼碱菌株pTiA6和发根农杆菌pRiA4 (Peralta等，1986)。章鱼碱超驱动序列的存在增强农杆菌细胞中单链T-DNA的形成，促进T-DNA转移到植物细胞中，并且对野生型侵入性是必需的(Peralta等，1986, Shurvinton和Reaml991)。当将pTiT37 (产生胭脂碱的Ti质粒)RB近端的顺式作用序列放置在pTiT37的LB重复序列之前时，后者能够产生高效的单链T-DNA，这表明类似超驱动的序列确实也存在于胭脂喊 Ti 质粒上(Culianez-Macia 和 Hepburn 1988, Peralta 等，1986),正如其在其他鉴定的(产生章鱼碱的)Ti质粒中一样。使异源的章鱼碱超驱动序列整合到胭脂碱pTiT37RB之前，导致比仅包含一个合成pTiT37RB重复序列的亲本菌株更大的侵入性(Peralta 等，1986)。VirCl蛋白结合到超驱动序列并且被认为可促进VirD2产生切口(Toro等，1988，1989)，而VirC突变导致了在植物中侵入性减弱(Close等，1987)和加工的单链T-DNA序列产量减少。根瘤农杆菌的章鱼碱和胭脂碱Ti质粒皆包含VirC并且可以与VirC突变反式互补以使减弱的侵入性恢复到野生型水平(Close等，1987)。在发根农杆菌菌株8196、A4和2659中发现的TSS与根瘤农杆菌中的超驱动序列起着相似的作用。每一种发根农杆菌菌株具有不同但相关的序列(Hansen等，1992)。8bp的TSS核心序列在pRiA4重复5次、在pRi8196中重复6次而在pRi2659 (Genbank登录号AJ271050)中重复17次(而不是Hansen等，1992中的16次)。除这些重复外pRiA4还具有保守的8bp超驱动核心序列。在pRiA4和pRi8196中更短的核心序列重复对于野生型侵入性而言是不足够的(Hansen等，1992)。Depicker等(美国专利公开2003/0140376和相应的国际公开W001/44482)描述了具有修改的T-DNA边界以减少或者阻止载体骨架序列的转移的重组构建体。Conner等(W0 05/121346)描述了 T-DNA边界类似区域的序列的产生和应用，该区域包含来自植物的序列。Heim等(美国公开2003/0188345)描述了具有修饰的边界区的载体用于农杆菌介导的植物转化。Lassner等(美国公开2006/0041956)描述了对T-DNA边界区域进行修饰以能够鉴定不包含非T-DNA序列的转基因事件。虽然前述的研究增加了对现有技术的理解，但是仍需要的是一种方法来提高农杆菌介导的植物转化效率。尽管与缺少这些序列的质粒相比，超驱动或者TSS序列的存在增加了野生型农杆菌的侵入性并且促进T-DNA转移到植物细胞中，但是如何进一步提高转化效率(包括通过使用超驱动或者TSS序列在内)仍是不清楚的。`专利技术概述一方面，本专利技术提供了增加细菌介导的植物转化效率的方法，其包含如下步骤:a)将至少一个附加的转化增强子序列引入到包含至少一个T-DNA边界区域的植物转化载体中；b)通过细菌介导的转化用上述载体转化植物细胞，其中所述细菌能够对植物细胞进行转化。该方法任选可包括从植物细胞再生转基因植株。在一个实施方案中，所述附加的转化增强子序列包含TGTWTGTK(SEQ ID NO:20)的共有核心序列。在其他实施方案中，所述附加的转化增强子序列选自:SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO: 13，和与 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9 或者 SEQ ID NO:13中的任意一个互补的序列。在具体的实施方案中，本专利技术提供了包含SEQ ID NO: 14,SEQID NO:15或者SEQ ID NO:16的重组DNA构建体。本专利技术所用的转化增强子序列可位本文档来自技高网...

【技术保护点】
用包含T?DNA边界序列的重组DNA构建体转化的转基因植物细胞，所述边界序列可操作地连接到转化增强子序列，后者包含选自以下序列的两个或更多个拷贝：SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：13、与SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9和SEQ?ID?NO：13中的任一个互补的序列、及它们的组合。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：X·叶，L·吉尔伯森，
申请(专利权)人：孟山都技术有限公司，
类型：发明
国别省市：