本发明专利技术提供一种β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)检测试剂盒，其包括PCR反应液（1）、PCR反应液（2）和混合酶液，所述PCR反应液（1）包括β-地中海贫血IVS-Ⅱ654（C→T)上游引物（1）、探针以及下游引物；所述PCR反应液（2）包括β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)上游引物（2）、所述探针以及下游引物；所述上游引物（1）为：5’-TTGCATATTCATAATCTCCCTAC-3’；所述上游引物（2）为：5’-ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT-3’；所述探针为：5’-(FAM)TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT(DABCYL)-3’；所述下游引物为：5’-AGGGCCTAGCTTGGACTCAG-3’。本发明专利技术β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)检测试剂盒检测标本，仅需3小时即可完成检测，同时检测β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)特异性较强，有效克服了β-地中海贫血PCR-反向点杂交法、基因检测技术中存在的周期长、操作繁琐，需要送到专门检测单位的缺点。?
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)检测试剂盒，其包括PCR反应液（1）、PCR反应液（2）和混合酶液，所述PCR反应液（1）包括β-地中海贫血IVS-Ⅱ654（C→T)上游引物（1）、探针以及下游引物；所述PCR反应液（2）包括β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)上游引物（2）、所述探针以及下游引物；所述上游引物（1）为：5’-TTGCATATTCATAATCTCCCTAC-3’；所述上游引物（2）为：5’-ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT-3’；所述探针为：5’-(FAM)TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT(DABCYL)-3’；所述下游引物为：5’-AGGGCCTAGCTTGGACTCAG-3’。本专利技术β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)检测试剂盒检测标本，仅需3小时即可完成检测，同时检测β-地中海贫血IVS-Ⅱ654(C→T)特异性较强，有效克服了β-地中海贫血PCR-反向点杂交法、基因检测技术中存在的周期长、操作繁琐，需要送到专门检测单位的缺点。【专利说明】β -地中海贫血IVS-1I 654 (C - T)检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法
本专利技术属于分子生物学和遗传学领域，更具体地，涉及一种β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)检测试剂盒及β -地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)点突变ARMS-QPCR检测方法。
技术介绍
β地中海贫血(β-mediterranean anemia)是指β链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。患儿出生时无症状，多于婴儿期发病，生后3~6个月内发病者占50%，偶有新生儿期发病者。发病年龄愈早，病情愈重。严重的慢性进行性贫血，需依靠输血维持生命，3~4周输血I次，随年龄增长日益明显。因本病的病因多为点突变，故常用PCR加ASO才能明确突变点，我国各民族的β地贫基因突变情况有一定差异，南方汉族的突变基因以⑶41-42(-TCTT)、⑶L7(A — Τ)、IVS-11-654 (C — T)和TATA-box28(A — G)为主，占85%~90%。双重杂合子的突变组合可达近100种，β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)是众多β -地中海贫血突变位点中的一种。扩增阻滞突变系统(amplificationrefractory mutation system),又名等位基因特异PCR(allele specific PCR，ASPCR)是验证性检测DNA序列变化的经典方法之一，典型的ARMS过程包含两个PCR扩增过程，引物有两对，它们的的区别在于3’端不同，一条引物能与“正常”的靶DNA互补，另一条与“非正常”的靶DNA互补，因此两个扩增反应只能扩增“特定”的DNA模板，因此要求3’末端核苷酸必须等位特异。目前对该β_地中海贫血检测方法一般是采用PCR-反向点杂交法、基因检测技术等明确b珠蛋白基因的异常位点，检测时间长，而且操作繁琐，基因检测技术需要送到专门检验单位去检查，费时费力。
技术实现思路
本专利技术解决了现有技术中的不足，提供一种灵敏度高、误差小、安全快速检测的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒及β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)点突变的ARMS-QPCR检测方法。本专利技术的技术方案为:一种β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒，其包括PCR反应液(I )、PCR反应液(2)和混合酶液，所述PCR反应液(I)包括β -地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)上游引物(I)、探针以及下游引物；所述PCR反应液(2)包括β-地中海贫血IVS-1I 654 (C-T)上游引物(2)、所述探针以及下游引物； 所述上游引物(I)为:5，- TTGCATATTCATAATCTCCCTAC -3，； 所述上游引物(2)为:5’ - ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT -3’ ；所述探针为:5’ -(FAM) TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT (DABCYL)-3’； 所述下游引物为:5’ - AGGGCCTAGCTTGGACTCAG -3’。在本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，在对所述上游引物(I )、上游引物(2)、探针以及下游引物进行引物设计时，所述上游引物(I)和上游引物(2)的3’末端与待检位点碱基匹配与错配，共用下游引物和探针；所述上游引物(I)和上游(2)的3’末端倒数第2位碱基错配，共用下游引物和探针。在本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，所述碱基错配方式为A — T或G — C互换。在本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，其还包括β-地中海贫血IVS-1I 654(C-T)的阴性对照液和阳性对照品，所述阴性对照液为不含有β-地中海贫血IVS-1I 654(C — Τ)基因的Tris-EDTA缓冲液，其浓度为0.0lM~0.015Μ, pH为8.00~8.02 ;所述阳性对照品为β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)突变型DNA合成阳性模板和β -地中海贫血IVS-1I 654野生型DNA合成阳性模。。在本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，所述上游引物(I)的浓度为50 μΜ，其体积为0.1~0.2 μ I /管；所述上游引物(2)的浓度为50 μ Μ，其体积为0.1~0.2 μ I/管；所述下游引物的浓度为50 μΜ，其体积为0.1~0.2μ1 /管；所述探针的浓度为50μ Μ,其体积为0.1~0.2 μ I /管。在本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，所述PCR反应液(I)和PCR反应液(2)均包括灭菌超纯水、IOXBuffer缓冲液、氯化镁和dNTPs，所述灭菌超纯水的体积为4.8~11.4μ I /管,所述IOX Buffer缓冲液中不含镁离子,其体积为2~4 μ I /管；所述氯化镁的浓度为25mM，其体积为2~4 μ I /管；所述dNTPs的浓度为2.5mM，其体积为2~4 μ I /管。在本专利技术的一个较佳实施例中,进一步包括,所述混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水和显色液，所述DNA聚合酶为Taq酶，其浓度为5U/ul，体积为00.15~0.3μ I /管；所述灭菌超纯水的体积为1.84~1.68 μ I /管；所述显色液为溴酹兰,其体积为0.01~0.02 μ I / 管。在本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，一种使用本专利技术所述的地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒的β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)点突变的ARMS-QPCR检测方法，包括如下步骤: (1)提取β-地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)的DNA样品； (2)将步骤(I)中获得的DNA样品进行荧光定量PCR检测，荧光定量PCR检测步骤中使用该β -地中海贫血IVS-1I 654 (C — Τ)检测试剂盒。在本专利技术的一个较佳实施例中，进一步包括，步骤(2)中所述的荧光定量PCR检测的条件为:50 ~55?:2 ~5min ；94 ~95?:2 ~3min ； 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β?地中海贫血IVS?Ⅱ654(C→T)检测试剂盒，其包括PCR反应液（1）、PCR反应液（2）和混合酶液，其特征在于，所述PCR反应液（1）包括β?地中海贫血IVS?Ⅱ654（C→T)上游引物（1）、探针以及下游引物；?所述PCR反应液（2）包括β?地中海贫血IVS?Ⅱ654?(C→T)上游引物（2）、所述探针以及下游引物；所述上游引物（1）为：5’??TTGCATATTCATAATCTCCCTAC??3’；所述上游引物（2）为：5’??ACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGCT??3’；所述探针为：5’?(FAM)?TTTCTGCATATAAATTGTAACTGAT?(DABCYL)?3’；所述下游引物为：5’??AGGGCCTAGCTTGGACTCAG??3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：龚剑，
申请(专利权)人：苏州发士达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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