一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法技术

本发明专利技术公开了一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，其包括以下步骤：将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH值为4.5的10mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤系统进行置换缓冲系统的处理，将其置于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。大幅度增加了修饰效率，实现了蛋白质药物性能的改善，本发明专利技术通过特定的偶联反应工艺，有利于偶联产物的后续提纯，提高了目标产品回收率，降低了聚乙二醇干扰素的制造成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，其包括以下步骤：将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH值为4.5的10mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤系统进行置换缓冲系统的处理，将其置于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。大幅度增加了修饰效率，实现了蛋白质药物性能的改善，本专利技术通过特定的偶联反应工艺，有利于偶联产物的后续提纯，提高了目标产品回收率，降低了聚乙二醇干扰素的制造成本。【专利说明】—种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及。
技术介绍
干扰素(英文名称为interferon,简称为IFN)是一种由人体细胞分泌的在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性，其活性发挥受细胞基因组的调节和控制并涉及RNA和蛋白质的合成。目前，干扰素是应用广泛且临床效果显著的治疗性药物，其广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能，在病毒性疾病治疗中有不可取代的作用，但普通干扰素用于临床治疗时，通常为胃肠外给药，体内药物代谢的半衰期短，免疫原性强，导致给药间隔短，给药频度高，人体内产生抗体也导致药效降低，难以达到较理想的临床效果。近年来，聚乙二醇修饰技术有效地解决了蛋白质药物的此类缺陷。聚乙二醇(英文名称为interfeixm，简称为PEG)是一种惰性无毒、可生物降解的有机多聚物，在生物技术和制药领域有着广泛的用途，聚乙二醇修饰技术就是通过共价结合将聚乙二醇连接到活性蛋白质上，蛋白质药物经聚乙二醇化后，空间结构发生改变。聚乙二醇具有空间位阻，将蛋白质表面的抗原决定簇掩盖起来，使蛋白质分子不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，抑制相应的免疫反应。另外，蛋白质化学修饰之后，修饰剂与蛋白质分子偶联，使得蛋白质的分子量增大，空间结构发生改变。当修饰后的蛋白质分子量达到或超出肾小球滤过作用的阈值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球滤过作用，因而可以在血液循环中停留更长的时间。蛋白质药物的聚乙二醇化已经成为蛋白类药物的发展方向，虽然通过聚乙二醇对蛋白质药物进行修饰可以获得种种优点，但是蛋白质药物修饰是一个复杂的过程，很多因素对蛋白质的化学修饰反应 会造成较大的影响。包括修饰剂的选择、修饰反应的条件、修饰后是否易于分离、纯化等等。因此对某一种药物而言，有必要建立其聚乙二醇修饰的最优化方法。现有技术中对干扰素的聚乙二醇修饰，反应后目标产物的回收率较低，成本较高，很难广泛地进行临床应用。因此，现有技术还有待于更进一步的改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供，通过优化聚乙二醇修饰蛋白质的偶联条件，包括pH、温度、反应介质、反应物配比等，提高偶联效率，易于后续产物的分离纯化，降低生产成本。本专利技术的技术方案如下: ，其包括以下步骤: A、将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH值为4.5的10 mM醋酸钠缓冲液终止上述反应,得到偶联反应液；B、将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度>95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤进行置换缓冲系统的处理，将其置换于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。所述的偶联方法，其中，在所述步骤A之前还包括:将重组人干扰素原液通过切向流超滤系统浓缩至蛋白浓度为2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸盐缓冲液渗滤，得到所述重组人干扰素浓缩液。所述的偶联方法，其中，所述步骤A具体的包括: 将所述活化聚乙二醇溶解于冷却至2V _8°C的乙腈溶液中，使其终浓度为40-80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量为所述重组人干扰素浓缩液蛋白总量的2-8倍；所述偶联反应在碱性条件下进行。所述的偶联方法，其中，所述步骤B具体的包括:以2-6倍的醋酸钠缓冲液平衡上样后的离子交换层析柱，再以含20 mM -SOmM氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，根据紫外检测仪分段收集洗脱峰，以SDS-PAGE电泳法检测纯度，得到纯度> 95%之单修饰的聚乙二醇干扰素。本专利技术提供了，以乙腈代替了传统工艺中的盐酸作为活化聚乙二醇的溶解剂，活化聚乙二醇在有机溶剂中更为稳定，可增加活化基团与蛋白质氨基的作用，提高偶联效率与目标产物回收效率；其二，偶联反应的PH环境采用碱性条件反应，在不同PH条件下，蛋白的电荷性质不同，导致亲核反应的能力有差别，使得聚乙二醇修饰的特异性发生变化，在碱性条件下反应，大幅度增加了修饰效率，实现了蛋白质药物性能的改善，其三，反应温度2-8°C，低温条件下反应，有利于保留蛋白活性，其四，PEG用量的选择，PEG用量越大，修饰率和修饰多态性越高，一般增加PEG分子量可延长药物的循环半衰期，但除个别蛋白的PEG修饰对蛋白质活性影响不大外，大多数蛋白质的活性随着修饰PEG数目和分子量的增加而降低，因此在修饰率、修饰多态性、活性保留率和成本之间需寻求平衡点；本专利技术通过特定的偶联反应工艺，有利于偶联产物的后续提纯，提高了目标产品回收率，降低了聚乙二醇干扰素的制造成本。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术中偶联方法的流程示意图； 图2为本专利技术中实施例1、实施例2、实施例3与实施例4各自得到之聚乙二醇干扰素的电泳检测图谱； 图3为本专利技术中得到之聚乙二醇干扰素的同分异构体分析图谱。图4为本专利技术中实施例1、实施例2、实施例3与实施例4各自得到之聚乙二醇干扰素的偶联率对比图，其中，图中第1-4道分别是:实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、PEG IFN对照及分子量标准； 图5为聚乙二醇干扰素a2b原液检测结果； 图6为聚乙二醇干扰素a2b的偶联率检测结果； 图7为聚乙二醇干扰素a2b的收获率检测结果 。【具体实施方式】本专利技术提供了，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供了，如图1所示的，其包括以下步骤: 步骤101:将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以PH值为4.5的10 mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液； 步骤102:将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度> 95%的单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤进行置换缓冲系统的处理，将其置换于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。更进一步的，在所述步骤101之前还包括:将重组人干扰素原液通过切向流超滤系统浓缩至蛋白浓度为2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸盐缓冲液渗滤，得到所述重组人干扰素浓缩液。在本专利技术的另一较佳实施例中，所述步骤101具体的包括: 将所述活化聚乙二醇溶解于冷却至2V _8°C的乙腈溶液中，使其终浓度为40-80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量为所述重组人干扰素浓缩液蛋白总量的2-8倍；所述偶联反应在碱性条件下进行。以乙腈代替了传统工艺中的盐酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法，其包括以下步骤：A、将重组人干扰素浓缩液与活化聚乙二醇溶液混合充分进行偶联反应后，再以pH4.5的10?mM醋酸钠缓冲液终止上述反应，得到偶联反应液；B、将所述偶联反应液通过离子交换层析分离得到纯度≥95%之单修饰的聚乙二醇干扰素，将所述单修饰的聚乙二醇干扰素通过切向流超滤进行置换缓冲系统的处理，将其置换于磷酸钠缓冲液中，最终得到聚乙二醇干扰素蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芃实，贺永山，卡特琳娜·阿尔瓦斯，刘长春，
申请(专利权)人：长春海伯尔生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：