本发明专利技术涉及转化了埃希氏菌(Escherichia?sp.)来源的果糖激酶基因以表达果糖激酶的棒杆菌(Corynebacterium?sp.)以及利用该菌株生产L-氨基酸的方法，所述果糖激酶显示出足以将果糖转化为果糖-6-磷酸的活性，从而阻止不必要的能量损耗。本发明专利技术的转化的棒杆菌能从埃希氏菌来源的果糖激酶基因表达果糖激酶，以阻止果糖代谢期间不必要的能量损耗，产生更具成本效益的L-氨基酸的生产。因此，其可以被广泛用于有效生产L-氨基酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及转化了埃希氏菌(Escherichia?sp.)来源的果糖激酶基因以表达果糖激酶的棒杆菌(Corynebacterium?sp.)以及利用该菌株生产L-氨基酸的方法，所述果糖激酶显示出足以将果糖转化为果糖-6-磷酸的活性，从而阻止不必要的能量损耗。本专利技术的转化的棒杆菌能从埃希氏菌来源的果糖激酶基因表达果糖激酶，以阻止果糖代谢期间不必要的能量损耗，产生更具成本效益的L-氨基酸的生产。因此，其可以被广泛用于有效生产L-氨基酸。【专利说明】用来源于埃希氏菌(Escherichia sp.)的果糖激酶基因转 化的棒杆菌(Corynebacterium sp.)及使用该棒杆菌制备L-氨基酸的方法
本专利技术涉及用埃希氏菌(Escherichia sp.)来源的基因转化的棒杆菌(Corynebacterium sp.)及使用该棒杆菌菌株生产L-氨基酸的方法。
技术介绍
棒杆菌,具体来说，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),是用于生产L-氨基酸的革兰氏阳性的微生物。诸如L-赖氨酸的L-氨基酸被广泛用于动物饲料生产、人类药品生产、制药工业等，并通过使用棒杆菌菌株的遗传工程方法来大量生产。由于工业发展，对L-氨基酸的不断增加的需求导致需要开发改良的棒杆菌菌株，以更有效和更经济地生产L-氨基酸。一般来说，通过将特定的DNA(如L-氨基酸生物合成相关的基因)引入棒杆菌菌株内或者通过改良棒杆菌菌株的活力已经可以增加棒杆菌的L-氨基酸生产。例如，韩国专利公开第2001-51915号和第2001-62279号公开了通过来源于谷氨酸棒杆菌的sucC和sucD基因以及zwa2基因的低表达，增加棒杆菌的L-氨基酸生产力的方法。韩国专利公开第2001-62272号公开了通过来源于谷氨酸棒杆菌的zwal基因的过表达，增加棒杆菌的L-氨基酸生产力的方法。日本专利第1995-121228号公开了引入来源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的编码柠檬酸合酶的基因的方法。同时，棒杆菌能利用蔗糖、葡萄糖和果糖作为碳源。其中，蔗糖被磷酸转移酶系统(PTS)磷酸化并被运送到细胞内。随后，磷酸化的蔗糖被转化酶水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖。产生的葡萄糖-6-磷酸进入糖酵解，而未磷酸化的果糖则被从细胞输出。其被PTS磷酸化，随后被运送到细胞内，并在糖酵解中被利用。利用果糖作为碳源需要相对复杂的代谢途径，因为棒杆菌没有果糖激酶活性(Appl Environ Microbiol.(1996) 62:3878-3880)。另一方面，在表达果糖激酶的细菌内，蔗糖被转化酶水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖，且果糖被果糖激酶磷酸化。随后，葡萄糖-6-磷酸和磷酸化果糖可以进入糖酵解途径。 使用果糖作为培养棒杆菌的碳源有一个问题，由于复杂的代谢途径，其需要不必要的能量损耗，因此已经进行了许多研究来解决这一问题。例如，本专利技术专利技术人开发了使用转化的菌株生产L-赖氨酸的方法，所述转化的菌株通过将来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的果糖激酶基因引入棒杆菌内来制备(韩国专利第564805号)。然而，随后的研究表明，用果糖激酶基因转化的棒杆菌具有非常低的果糖激酶活性，且当使用蔗糖作为培养棒杆菌的碳源时，来源于蔗糖的一部分果糖被转化为果糖-6-磷酸，且余下的部分在细胞外被PTS磷酸化，随后被运送到细胞内，这如同野生型内的情形，因此引入果糖激酶基因并不提供足够的产出。因此，有必要探索其他显示出足以在棒杆菌内将果糖转化成为果糖-6-磷酸的活性的果糖激酶基因。从对调节蔗糖吸收和水解作用以赋予蔗糖同化能力的基因的研究中，鉴定出了期望的果糖激酶基因，且通过以下例证:沙门氏菌(Salmonella)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)和解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)中发现的 scr 调节子(J.Bacteriol.，151:68-76，1982;Mol.Microbiol.，2:1-8，1988;J.Bacteriol.，173:7464-7470，1991;J.Gen.Microbiol.，134:1635-1644，1988;J.Bacteriol.，182:5351-5358，2000;USP7, 179，623);来源于埃希氏菌的 csc 调节子(Appl.Environ.Microbiol., 58:2081-2088, 1992; USP6, 960，455)以及来源于革兰氏阳性的微生物-变异链球菌(Streptococcus mutans)的scr调节子和sac操纵子(J.Bacteriol.，171:263-271，1989)。其中，在埃希氏菌中发现了两种果糖激酶基因(cscK和mak)。cscK是属于csc调节子的果糖激酶基因，且已知与cscB (质子同向转运型鹿糖通透酶)和cscA (蔗糖水解酶)一起参与蔗糖代谢(J.Bacteriol.，184:5307-5316，2002)。Mak是编码甘露糖激酶的基因，且已知甘露糖激酶具有将诸如甘露糖、果糖和葡萄糖的己糖转化为 6-磷酸-酯形式的活性(Mol.Microbiol.，5:2913-2922，1991)。专利技术概述抟术问是页因此，本专利技术专利技术人分离了埃希氏菌的果糖激酶基因(cscK和mak)，并用该基因转化棒杆菌菌株以提供具有增加的氨基酸生产力的菌株，从而完成本专利技术。_0] 技术方案本专利技术的一个目的是提供用埃希氏菌来源的果糖激酶基因转化以表达果糖激酶的棒杆菌，所述果糖激酶显示出足以在细胞内将果糖转化为果糖-6-磷酸的活性，而不需要通过水解磷酸化的蔗糖产生的胞内果糖在输出后的再次进入，从而阻止不必要的能量损耗。本专利技术的另一目的是提供生产L-氨基酸的方法，包括培养转化的棒杆菌和从其收集L-氨基酸的步骤。本专利技术的另一目的是提供生产L-氨基酸的方法，包括在含有蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的棒杆菌和从其收集L-氨基酸的步骤。本专利技术的有益.效果本专利技术的转化的棒杆菌能表达埃希氏菌来源的果糖激酶，从而避免果糖代谢期间不必要的能量损耗，产生更具成本效益的L-氨基酸生产。因此，其可以被广泛用于有效生产L-氨基酸。附图简要说明图1是显示培养用果糖激酶基因转化的谷氨酸棒杆菌后，存在于培养基中的蔗糖和果糖的定量结果的图。实施专利技术的最佳方式一方面，为了实现上述目标，本专利技术提供了用于生产L-氨基酸的棒杆菌，其包含可操作地连接至基因表达单元的埃希氏菌来源的果糖激酶基因。就这一点而言，果糖激酶基因并不具体受限，且优选为cscK或mak，且最优选为cscK。根据本专利技术的一个实施例，cscK具有SEQ ID N0.17的核苷酸序列，且mak具有SEQ ID N0.18 的核苷酸序列。此外，基因表达单元被可操作地连接至载体，且优选通过转化插入到棒杆菌内，或通过插入棒杆菌的染色体中而并入。该基因优选通过基因表达调控区的修饰而被过表达。例如，除了基因上游的固有启动子，还可以连接其他的异质启动子，且异质启动子的例子可以包括pcj7启动子、IysCPl启动子本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：裵贤原，金亨俊，文准玉，张在佑，金锺哲，金泰韩，成珍锡，李庚翰，金大哲，金孝珍，裵贤爱，林相曹，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：
国别省市：
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