本发明专利技术属于生物基因工程及酶工程领域，特别是涉及一种来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的优化、表达及其应用。将来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobactersuccinogenes）的β-葡聚糖酶基因SEQIDNO.2通过密码子优化得到SEQIDNO.3所示的优化葡聚糖酶基因；此基础上构建了葡聚糖酶基因的酵母表达载体pPIC9K-GLUm，转化毕赤酵母GS115。经核苷酸序列优化的β-葡聚糖酶基因GLUm表达的酶活力比优化前提高25.1%。经高密度发酵，GLUm葡聚糖酶的活力为51976U/g干培养物。纯化β-葡聚糖酶在胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同作用60min后，仍保留了50.5%的酶活力，这种优化的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶可用于非治疗目的降解β-葡聚糖的应用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物基因工程及酶工程领域，特别是涉及一种来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的优化、表达及其应用。将来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobactersuccinogenes）的β-葡聚糖酶基因SEQIDNO.2通过密码子优化得到SEQIDNO.3所示的优化葡聚糖酶基因；此基础上构建了葡聚糖酶基因的酵母表达载体pPIC9K-GLUm，转化毕赤酵母GS115。经核苷酸序列优化的β-葡聚糖酶基因GLUm表达的酶活力比优化前提高25.1%。经高密度发酵，GLUm葡聚糖酶的活力为51976U/g干培养物。纯化β-葡聚糖酶在胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同作用60min后，仍保留了50.5%的酶活力，这种优化的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶可用于非治疗目的降解β-葡聚糖的应用。【专利说明】一种来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的优化、表达及其应用
本专利技术属于生物基因工程及酶工程领域。特别是涉及一种来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的优化、表达及其应用。
技术介绍
我国是一个人口大国，也是一个农业大国。在以畜牧业为主的农业大国里，人畜争粮的矛盾十分突出，饲料原料资源的严重匮乏阻碍了畜牧业的发展。要保持我国畜牧业的持续发展，必须首先解决好饲料问题。对于单胃动物而言，解决人畜争粮问题的途径是开发利用非常规饲料，即降低玉米在饲粮配方中的比例而增加麸皮、大麦等饲料原料的比重。对于反刍家畜来说，充分利用农区大量农作物秸杆资源则有助于解决这一问题。但是，麦类和农作物稻杆中均含较高比例的非淀粉多糖(NSP, non-starch polysaccharides),如β -葡聚糖、阿拉伯木聚糖等，因此妨碍其消化吸收，造成畜禽动物饲料利用率降低、生长受阻以及排泄粘粪、污染环境等。麦类饲料从营养组成上，其潜在的营养价值较高，有些营养成分甚至高于玉米，但含量较高的水溶性NSP限制了其在畜禽饲料中的广泛应用。β -葡聚糖是植物细胞壁的多糖成分。由于β -葡聚糖会包裹一些营养物质，使消化酶不能接触底物，从而降低饲料的营养价值。同时，某些β_葡聚糖如β_1，3-1，4-葡聚糖具有水溶性，可以使饲料在动物肠道中具有很大的黏性，给动物的生长和生产带来负面影响。饲料中添加β_葡聚糖酶可有效降解β_葡聚糖的抗营养作用。目前，用于工业和畜牧业的葡聚糖酶一般来自于可培养环境微生物的固体培养物，较典型的有芽孢杆菌属、木霉属以及青霉属等。普遍认为，可培养微生物只占自然界微生物的I %，那么剩余的99%的不可培养的微生物中蕴藏着大量的β -葡聚糖酶资源，其中很可能存在高活力、更适宜动物消化道的葡聚糖酶。这为寻找和筛选新的葡聚糖酶类提供了一条新的途径。反刍动物瘤胃被认为是目前转化NSP效率最高的生物反应器。瘤胃中栖居了大量的细菌、真菌和原虫，其中细菌和真菌是降解纤维质的主体生物。目前，针对瘤胃纤维降解微生物资源以及基因资源的发掘研究工作正在逐渐成为酶学领域的研究热点。产琥拍酸丝状杆菌sWcciflogefles)是反会家畜瘤胃中降解植物细胞壁的主要微生物之一。从该细菌中先后分离出数种降解纤维素和半纤维素的酶类。由产琥珀酸丝状杆菌产生的@-1，3-1，4-葡聚糖酶化.(:.3.2.1.73，简称β-葡聚糖酶)被认为是比活力最高的。然而由于产琥珀酸丝状杆菌属于厌氧细菌，培养条件苛刻，因此其在工业上还未得到应用。基因工程技术是目前大量获得目的蛋白的常用方法。常用的表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统等。吕文平等(2004)从地衣芽孢杆菌UaciJAz1SBcAmifbiTBi1S)基因组DNA中获得了 β -1, 3-1，4-葡聚糖酶基因，在大肠杆菌中表达后，酶活力为67.34 U/mL，其活力是出发菌的60倍(吕文平，许梓荣，杜文理，李卫芬，孙建义.地衣芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆和表达.农业生物技术学报，2004，12 (4):446-449)ο李永仙等(2009)则对来源于淀粉液化芽孢杆菌amyloliquefaciensBS5582的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因进行了表达，通过培养条件的优化，该基因在大肠杆菌中表达的最高活力为1883.3 U/mL (李永仙，谢焱，朱林江，张一心，顾国贤，李崎.淀粉液化芽孢杆菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆及表达.生物工程学报，2009，25 (4):542-548)。毕赤酵母表达系统因其培养条件简单、表达水平高、分泌表达、遗传稳定等特点，被用于多种蛋白质的表达。樊英等(2007)利用表达载体pPIC9k在毕赤酵母GS115表达了地衣芽孢杆菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶，酶活力最高达333.7U/mL,比活力为1334.8 U/mg(樊英.地衣芽袍杆菌来源β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因克隆、改造及其表达.2007，中国农业科学院学位论文)。Shyur等(2000)最早利用基因工程技术在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达产琥珀酸丝状杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，通过去除C端部分氨基酸以提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶的热稳定性(专利号:US7037696 BI)。Wen等(2005)则尝试在大肠杆菌和毕赤酵母Χ-33中表达产琥珀酸丝状杆菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶基因，在毕赤酵母中该基因的表达水平为1940 U/mL,要高于大肠杆菌中的表达水平(Wen Tuan-Nan, Chen Ju1-Lin, LeeShu-Hua, Yang Ning-Sun, and Shyur Lie-Fen.A truncated Fibrobacter succinogenesI, 3-1, 4-β -D-glucanase with improved enzymatic activity and thermotolerance.Biochemistry.2005, 44(25), 9197-9205)。在国内利用基因工程技术表达产琥珀酸丝状杆菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶基因的文献和专利还未见报道。开展NSP水解酶基因资源的发掘与利用对于畜牧业开发非常规饲料资源和农作物秸杆的高效利用，缓解粮食短缺危机及环境污染危机具有重要意义；同时对于生物质能源开发缓解能源危机也具有深远意义；另外，开展相关研究对于纺织、食品、酿酒、医药、造纸等工业领域的发展也具有积极的推动作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人工合成编码的产琥珀酸丝状杆菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶GLUm (简称β-葡聚糖酶GLUm)优化的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供包含上述优化的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述优化的产琥珀酸丝状杆菌β_葡聚糖酶基因的重组毕赤酵母菌株。本专利技术的另一目的是提供制备上述优化的产琥珀酸丝状杆菌β_葡聚糖酶的方法，该方法包括以下步骤: (1)采用全基因合成方法获得SEQID N0.3所示核苷酸序列； (2)构建含有SEQID N0.3所示核苷酸序列的表达载体pPIC9K_GLUm ； (3)将重组载体pPIC9K-GLUm转化宿主细胞GSl15，获得重组菌株；以本文档来自技高网...
【技术保护点】
优化的产琥珀酸丝状杆菌β?葡聚糖酶基因GLUm，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ?ID?NO.3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，杨玉霞，张慧玲，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：
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