一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法技术

本发明专利技术目的是提供一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法，本发明专利技术所制备出的TIL细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高等特点。本发明专利技术的主要特点是：利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对TIL进行培养，这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态，从而利于细胞接受各种因子的刺激，并且这两种蛋白本身就有对TIL细胞增殖的促进作用；而抗OX-40单克隆抗体的使用可以刺激TIL细胞中CD3+CD8+T细胞亚群的共刺激信号，促进细胞的活化，提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达，增强其杀伤能力。到目前为止，仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗OX-40单克隆抗体联合应用于TIL细胞制备的研究报道，本发明专利技术首次提供出一种在TIL细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术目的是提供一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法，本专利技术所制备出的TIL细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高等特点。本专利技术的主要特点是：利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对TIL进行培养，这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态，从而利于细胞接受各种因子的刺激，并且这两种蛋白本身就有对TIL细胞增殖的促进作用；而抗OX-40单克隆抗体的使用可以刺激TIL细胞中CD3+CD8+T细胞亚群的共刺激信号，促进细胞的活化，提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达，增强其杀伤能力。到目前为止，仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗OX-40单克隆抗体联合应用于TIL细胞制备的研究报道，本专利技术首次提供出一种在TIL细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。【专利说明】一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法
本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种肿瘤侵润淋巴细胞(TumorInfiltrating lymphocyte, TIL)的培养，即利用各种细胞因子的组合来刺激胸腹水来源的淋巴细胞，使其可以高效扩增。
技术介绍
肿瘤侵润淋巴细胞(Tumor Infiltrating lymphocyte, TIL)是指侵润到肿瘤组织周围的淋巴细胞，细胞表型以⑶3+CD8+T和⑶3+⑶4+T细胞为主，另外还有少量的NKT细胞和NK细胞。由于TIL细胞多数与肿瘤细胞发生过接触，所以理论上可以对肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用。但是，由于肿瘤微环境中，存在很强的免疫抑制因子，所以实际上TIL细胞的功能是受到极大的抑制，无法发挥对肿瘤细胞的有效杀伤作用。上个世纪八十年代，Rosenberg教授首次分离肿瘤组织中的TIL细胞，并通过白细胞介素2的刺激接来解除其免疫抑制状态，体外扩增后，用于回输治疗黑色素瘤患者，并取得了一定的效果。TIL细胞的来源主要有两个:1、手术切除的肿瘤组织或淋巴结；2、癌性胸腹水。从手术样品中分离TIL细胞需要经过机械剪切，多种蛋白酶的酶解等多个步骤，方法比较繁琐，而且最终能够分离并成功培养的比例不高，这很大程度上限制了手术样品来源TIL的临床应用。癌性胸腹水来源的TIL细胞，分离的方法相对简单，也容易在体外培养，所以在临床得到了较为广泛的应用。但是，由于使用传统方法，TIL在体外的扩增有限，通常20天左右的时间，细胞数量仅扩增20-50倍左右，且TIL细胞中⑶3+⑶8+T细胞的杀伤能力不高，极大的影响了 TIL细胞临床应用的效果。科研工作者不断探索培养TIL的新方法，比如在培养中期添加抗⑶3单克隆抗体、使用炎性因子等。因此，尽早建立一种高效扩增TIL细胞的方法，已成为国内外学着研究工作的目标。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法，即使用肿瘤患者的胸腹水，分离得到TIL细胞，在体外通过多种因子的刺激作用，使TIL细胞得到大量扩增，并提高其杀伤活性。 申请人:在长期的研究中发现，层粘连蛋白和纤维连接蛋白可以极大的提高TIL细胞的增殖速度；而抗0X-40单克隆抗体的添加可以有效的刺激TIL细胞的活化，上调CD3+CD8+T细胞中行使杀伤功能的穿孔素和颗粒酶的表达，提高其对肿瘤细胞的杀伤活性。 申请人:将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗0X-40单克隆抗体三种因子共用引入到TIL细胞的培养中，从而促成了本专利技术。本专利技术的TIL细胞的培养方法，包括如下的步骤:I)将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后，加入到细胞培养瓶中包被；2)将从胸腹水分离得到的TIL细胞用培养液重悬后，接种到包被后的培养瓶中；添加IL-2刺激；3)培养4天后，将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养，并添加抗0X-40单克隆抗体；4)持续扩大培养至第20天时，完成高效TIL细胞的培养。 本专利技术步骤2)所述的培养液，其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢|丐1200mg/ml、氨基酸 1365mg/ml、维生素 21.4mg/ml、微量元素 0.93126mg/ml、白蛋白 450mg/ml、胰岛素 8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺卩密唳0.12mg/ml。其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。维生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。微量元素的配比如下:85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。为了获得更好的培养效果，在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor, CGF)。本专利技术所制备出的TIL细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高等特点。本专利技术的主要特点是:利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对TIL进行培养，这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态，从而利于细胞接受各种因子的刺激，并且这两种蛋白本身就有对TIL细胞增殖的促进作用；而抗0X-40单克隆抗体的使用可以刺激TIL细胞中CD3+CD8+T细胞亚群的共刺激信号，促进细胞的活化，提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达，增强其杀伤能力。到目前为止，仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗0X-40单克隆抗体联合应用于TIL细胞制备的研究报道，本专利技术首次提供出一种在TIL细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。具体实施方法本专利技术所用的材料描述如下:抗0X-40单克隆抗体:鼠抗人0X-40单克隆抗体，购于安迪生物科技(上海)有限公司HTB-135细胞:人胃癌细胞系，购于中科院细胞库NC1-H596细胞:人肺癌细胞系，购于中科院细胞库HepG2细胞:人肝癌细胞系，购于中科院细胞库本专利技术的癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法，包括如下的步骤:I)培养瓶的包被:分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克，于20毫升的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置3-5小时。2)细胞接种:收集400-1000毫升的癌性胸腹水，1500转/分钟，离心10分钟。用30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml淋巴细胞分离液的离心管。2000转/分钟，离心15分钟。取中间白色的PBMC细胞层，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数后，接种到去包被液的培养瓶中。添加60000单位的IL-2。3)转移培养:接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中继续培养，添加无血清培养基至400毫升，添加200000单本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TIL细胞的培养方法，包括如下的步骤：1)将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后，加入到细胞培养瓶中包被；2)将从胸腹水分离得到的TIL细胞用培养液重悬后，接种到包被后的培养瓶中；添加IL?2刺激；3)培养4天后，将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养，并添加抗OX?40单克隆抗体；4)持续扩大培养至第20天时，完成高效TIL细胞的培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐矫健，孙威，
申请(专利权)人：青岛麦迪赛斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：