一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法技术

本发明专利技术提供一种生物工程技术领域的鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，即，选鲤鱼进行解剖，无菌取头肾并剪碎，经细胞筛过滤得细胞悬液，后经离心洗涤，加入细胞培养液得到新的细胞悬液；用血小球计数板进行计数，再以最适培养条件铺板法培养增殖，最后对得到的原代巨噬细胞多种方法镜检鉴定。本发明专利技术直接无菌取鲤鱼头肾，进行铺板法培养以提取巨噬细胞，经鉴定，确实得到了数量多、纯度高的离体鲤鱼原代巨噬细胞，保证了所提取离体细胞的成活率，为进一步开展鲤鱼巨噬细胞毒理试验及其他实验打下基础。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种生物工程
的鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，即，选鲤鱼进行解剖，无菌取头肾并剪碎，经细胞筛过滤得细胞悬液，后经离心洗涤，加入细胞培养液得到新的细胞悬液；用血小球计数板进行计数，再以最适培养条件铺板法培养增殖，最后对得到的原代巨噬细胞多种方法镜检鉴定。本专利技术直接无菌取鲤鱼头肾，进行铺板法培养以提取巨噬细胞，经鉴定，确实得到了数量多、纯度高的离体鲤鱼原代巨噬细胞，保证了所提取离体细胞的成活率，为进一步开展鲤鱼巨噬细胞毒理试验及其他实验打下基础。【专利说明】
本专利技术涉及一种生物工程
的细胞提取和鉴定方法，具体地说，涉及的是一种鲤鱼局部细胞的提取和鉴定方法。
技术介绍
鱼类的免疫系统是由非特异性免疫和特异性免疫组成。鱼类的免疫系统亦由免疫组织和器官、免疫细胞和体液免疫因子组成。而免疫细胞有两类:一类是淋巴细胞，主要进行特异性免疫反应；另一类是吞噬细胞，是非特异性免疫的关键成分，在抵御微生物感染方面具有重要作用。非特异性免疫系统在鱼类抵抗病原生物入侵时发挥着更为重要的作用。巨噬细胞是一种白血球，源自单核细胞，主要是以固定或游离细胞的形态对细胞残片和病原体进行吞噬和消化，再激活淋巴球等免疫细胞，使之对病原体做出反应，阻止其扩散和生长。所以巨噬细胞在鱼类免疫过程中占有极其重要的作用。鱼类巨噬细胞可从不同组织中得到，包括血液、免疫器官(如肾脏)和腹膜腔。鲤鱼属鲤科(Cyprinidae)，是一种原产亚洲的淡水鱼，在全国各地均有分布，是我国主要的养殖鱼种之一。鲤鱼具有很大的食用和观赏价值，深受我国广大消费者喜爱。所以作为我们生活中很常见的鱼种之一，鲤鱼和人类联系紧密，所以可以通过探索鲤鱼自身受环境影响程度进而来评估环境对人类的影响，而鲤鱼对环境刺激的反应源自于自身免疫系统的应激行为，所以作为鱼体中非特异性免疫的重要组成部分，巨噬细胞的变化可以更直观的体现应激过程，从而评估环境对其的影响程度。所以提取鲤鱼原代巨噬细胞对进行环境激素毒理实验具有十分重要的意义。所以本专利技术中提供的这种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法能够很好的保证离体巨噬细胞的数量和纯度，从而能够保证满足以鲤鱼巨噬细胞为实验对象的环境激素毒理实验及其他实验的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，即无菌剪取鲤鱼头肾，剪碎经筛网过滤，直接铺板过夜，洗去未贴壁的细胞，得到鲤鱼原代巨噬细胞。同时，利用多种方法经行镜检鉴定。本专利技术能保证所提取原代巨噬细胞的成活率和可靠性，为进一步开展鲤鱼巨噬细胞毒理实验打下基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的: 首先配制Hank’ s平衡盐工作液及培养基液。Hank’ s平衡盐工作液组成为:100 ml HBSS (Hank，s平衡盐溶液)，I ml 1%双抗储液，100 μ I 10U/ml Heparin (肝素钠)储液。铺板法所用最适培养基液组成为:95ml Leibovitz’s L-15培养基、5ml 5%FCS(小牛血清)、lml 0.01 M !fepes缓冲液(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、lml 1%双抗储液、100 μ I 10U/ml Heparin (肝素钠)储液；用I M NaOH储液调节pH至7.0-7.4之间，然后用0.22 μ m滤头过滤分装。其步骤如下: a.细胞的提取:选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周，饲养条件为，水温25 土 1° C，光照周期为光照:黑暗=14 h:10 h，每天两次喂食丰年虾。解剖鲤鱼，从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，找到红鲤鱼头肾所在位置，用灭菌解剖器具无菌取头肾并置于Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s平衡盐工作液清洗2-3次至头肾发白，将头肾剪碎成约I mm X I mm块状，经孔径为100 μπι细胞筛过滤得细胞悬液，用Hank’ s平衡盐工作液1000 rpm, 5 min离心洗涤细胞2次后弃上清，加入细胞培养液，吹打使细胞重悬。用血小球计数板进行计数，并用细胞培养液稀释，以铺板法培养鲤鱼巨噬细胞的最适培养条件铺板法贴壁培养增殖，最适条件为:细胞悬液稀释到 4X 107cells/ml浓度，24孔板铺进I X IO7 cells/孔，26°C条件下贴壁培养24h，用培养基反复洗涤2-3次洗去未贴壁的细胞后得到分离的原代巨噬细胞。(图1) b.细胞的鉴定:对得到的原代巨噬细胞镜检鉴定，分别用台盼蓝染色法、瑞氏-姬姆萨染色法和非特异酯酶染色法进行鉴定。本专利技术的优点是:提取鲤鱼原代巨噬细胞所需时间短，细胞数量多，纯度和成活率高，操作简单可行。鲤鱼原代巨噬细胞成功提取为分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域的深入研究奠定了基础。【专利附图】【附图说明】图1为细胞铺板数为IXlO7 cells时巨噬细胞贴壁24h后贴板密度。图2为巨噬细胞不同铺板密度下20°C和26°C培养存活细胞个数。图3为巨噬细胞不同铺板密度连续培养3天细胞死亡率。图4为台盼蓝染色法鉴定红鲤鱼巨噬细胞。图5为瑞氏-姬姆萨染色法鉴定红鲤鱼巨噬细胞。图6为a -NBE染色法鉴定红鲤鱼巨噬细胞。【具体实施方式】下面结合实施例作详细说明:本实施例在以本专利技术技术为前提下进行实施。实施例选择规格均匀、体格健壮的平均体重400_600g的鲤鱼预养2周，饲养条件为，水温25 土 1° C，光照周期为光照:黑暗=14 h:10 h，每天两次喂食丰年虾。实验前按组成为100 ml HBSS (Hank’s 平衡盐溶液)，I ml 1% 双抗储液，100 μ I 10U/ml H印arin (肝素钠)液配制Hank’s平衡盐工作液；按组成为:95ml Leibovitz’s L-15培养基、5ml 5%FCS (小牛血清)、lml 0.01 M !fepes缓冲液(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、lml 1%双抗储液、100 μ I 10U/ml肝素纳配制铺板法中所用的最适培养基液，并用I M NaOH储液调节pH至7.0-7.4之间，然后用0.22 ym滤头过滤分装。然后用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后用无菌注射器从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，打开左侧体壁肌肉，找到红鲤鱼头肾所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取头肾，并将之置于5 ml的Hank’ s平衡盐工作液中重悬，用Hank’ s平衡盐工作液清洗头肾组织2_3次至头肾发白，以洗去头肾组织中残留的血液。将头肾剪碎成约I mm X I mm块状，经孔径为100 μ m的细胞筛研磨筛选过滤,得3-5 ml细胞重悬液,1000 rpm离心5 min后,移去上清。继续用Hank’ s平衡盐工作液1000 rpm, 5 min离心洗涤细胞2次后弃上清，加入3ml细胞培养液，轻轻吹打，使细胞重悬。此过程要在无菌条件下严格操作。用血小球计数板对细胞悬液进行计数。计数时，血小球计数板共25个大格，每个大格放大后是4X4的小格，数血小球计数板的四个角以及中央位置的大格共5个大格，得到5个大格的细胞总数N，然后按下式计算:C:=^^xl04xn，单位为cells/ml。然后用细胞培养液将细胞悬液浓度稀释至4 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：a．??细胞的提取：选择规格均匀、体格健壮的平均体重400?600g的红鲤鱼预养2周；首先按组成为100?ml?HBSS，1?ml?1%双抗储液，100?μl?10U/ml?Heparin（肝素钠）储液配制Hank’s平衡盐工作液；还有培养基液，铺板法中所用对鲤鱼巨噬细胞的最适培养基液组成为：95ml?Leibovitz’s?L?15培养基、5ml?5%FCS（小牛血清）、1ml?0.01?M?Hepes缓冲液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）、1ml?1%?双抗储液、100μl?10?U/ml?Heparin（肝素钠）储液；并用1?M?NaOH储液调节pH至7.0?7.4之间，然后用0.22?μm滤头过滤分装；然后解剖鲤鱼，无菌取头肾并置于Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s平衡盐工作液清洗2?3次至头肾发白，将头肾剪碎成约1?mm?×?1?mm?块状，经孔径为100?μm?细胞筛过滤得细胞悬液，用Hank’s平衡盐工作液以1000?rpm，5?min离心洗涤细胞2次后弃上清，加入细胞培养液，吹打使细胞重悬；用血小球计数板进行计数，并用细胞培养液稀释，以最适培养条件铺板法贴壁培养增殖，用培养液洗去未贴壁细胞，然后对得到的原代巨噬细胞镜检鉴定；铺板法培养鲤鱼巨噬细胞的最适条件为：细胞悬液稀释到4×107cells/ml浓度，24孔板铺进1×107?cells/孔，26℃条件下贴壁培养24h；b.??细胞的鉴定：对得到的原代巨噬细胞镜检鉴定，分别用台盼蓝染色法、瑞氏?姬姆萨染色法和非特异酯酶染色法进行鉴定。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨明，裘文慧，陈静思，潘辰苑，雷湘杰，吴明红，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：