本发明专利技术提供一株产纤维素酶芽孢杆菌（Bacillussp.)H1，保藏编号为CGMCC?No.7395，经过优化得产纤维素酶培养基，每30ml中含麸皮0.2g、麦秆0.2g，氯化铵0.3g、蛋白胨0.1g，初始pH8.5。本发明专利技术方法简单快速，易于实施，对研究纤维素酶作用机理及纤维素酶制剂的生产具有潜在理论和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一株产纤维素酶芽孢杆菌（Bacillussp.)H1，保藏编号为CGMCC?No.7395，经过优化得产纤维素酶培养基，每30ml中含麸皮0.2g、麦秆0.2g，氯化铵0.3g、蛋白胨0.1g，初始pH8.5。本专利技术方法简单快速，易于实施，对研究纤维素酶作用机理及纤维素酶制剂的生产具有潜在理论和应用价值。【专利说明】一株产纤维素酶菌株H1及其产酶培养基
本专利技术属于微生物
，具体涉及一株产纤维素酶菌株Hl及其产酶培养基。
技术介绍
纤维素材料是自然界中最丰富的可再生资源，利用现在生物技术将纤维素材料转化为乙醇等液体燃料，不仅可以作为新资源新能源为人类造福，缓解或解决化石能源对环境污染的问题，同时也可以实现对农业剩余资源的高效利用，现已受到世界各国的普遍重视。采用微生物技术处理秸杆是当前研究最多的一种秸杆处理方法，纤维素酶能将天然纤维素降解，生成纤维素分子链、纤维素二糖和葡萄糖，然而目前主要制约纤维素材料转化为乙醇产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下，造成生产成本过高。因此，筛选具有高活性纤维素酶的秸杆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。目前研究较多的是霉菌，其中木霉、曲霉、根霉和青霉均具有较强的酶活力，尤以绿色木霉、里氏木霉和康氏木霉为典型。而对于细菌的研究很少有报道。有细菌所产生的纤维素酶一般最适pH为中性至偏碱性，近20年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉纺织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株产纤维素酶菌株Hl及其产酶培养基，对研究产纤维素酶作用机理及纤维素酶制剂的生产具有潜在理论和应用价值。本专利技术的芽孢杆菌(Bacillus sp.)H1，已于2013年4月I日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，菌株保藏编号为= CGMCC N0.7395。本专利技术对对菌株Hl的产酶能力进行初步优化，得到其最佳产酶培养基为每30ml中含麸皮0.2g、麦杆0.2g，氯化铵0.3g、蛋白胨0.lg，初始pH 8.5。【专利附图】【附图说明】图1为酶活鉴定板上菌株的水解圈情况图2为用草酸铵结晶紫染料于载玻片上对其进行简单染色，并在油镜下观察其形态特征 图3为16s rDNA扩增结果电泳图 图4为Hl 16s rDNA系统进化树 图5为因素指标趋势图【具体实施方式】本专利技术用下列具体实施例来进一步说明本专利技术。实施例:1材料与方法1.1材料 主要试剂:羧甲基纤维素钠、硝基水杨酸试剂(称取酒石酸钾钠91g，溶于500mL蒸馏水中，加热至50°C，再依次加入3，5- 二硝基水杨酸(DNS) 3.5g, NaOH 20g,苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌完全溶解。冷却后用蒸馏水定容至1L。储于棕色瓶中4°C保存，放置一周后使用，使用前过滤)、PH4.6醋酸缓冲液:所述醋酸缓冲液由冰醋酸与醋酸钠配置、刚果红、无水葡糖糖,PCRmix酶(购自北京天根公司)，胶回收试剂盒(购自大连TaKaRa公司)，化学试剂均为分析纯； 培养基:(灭菌条件均为120°C 20min) 富集培养基，IL中含=CMC-Na IOg黄豆饼粉5g (NH4)2SO4 2.5g pH 8.5 初筛培养基，IL中含:CMC-Na IOg黄豆饼粉5g (NH4)2SO4 2.5g pH 8.5琼脂15g 斜面保藏培养基，IL中含:麸皮70g黄豆饼粉30g (NH4)2SO4 2.5g pH 6.0琼脂20g 液体发酵培养基，IL中含:CMC-Na IOg麸皮IOg (NH4)2SO4 3g MgSO4酵母膏0.5g CaCl2 0.4g KH2PO4 Ig 蛋白胨 2g pH 8.5 1.2方法 (I)样品采集:采集附近草丛中的土壤样品，用于分离选育纤维素降解菌。(2)富集初筛:取Ig样品粉末置于无菌三角瓶中，所述无菌三角瓶中含30mL富含培养基，在25°C和220rpm下，摇床培养48 ;取富集后的培养液按10_2、10' 10_4、10_6、10_8配制不同梯度稀释液，分别涂布于初筛培养基中，导致恒温培养箱28°C，培养65h，往平板中加入lmg/mL刚果红溶液10mL，染色lh，弃去染液后，加入10_12mL的lmol/L的NaCl溶液，洗涤lh，分离能够旺盛生长，并在刚果红染色、NaCl脱色后能观察到菌落周围有明显透明水解圈的菌株，接种于斜面保藏培养基中25°C培养48h后，4°C低温保存。(3)发酵复筛:将初筛得到的产纤维素酶菌株以I环/30mL培养基的接种量接种到液体发酵培养基中，于30°C，180rpm，振荡培养5天后，测定初酶液CMC酶活，最终以酶活值做为筛选纤维素酶高产菌的标准，筛选CMC酶活高的菌株，采用3，5- 二硝基水杨酸发测定CMC酶活。(4)菌种初步鉴定:经初筛、复筛得到CMC酶活性较高的菌株，观察期菌落的形态特征；通过革兰氏染色，在显微镜下观察菌的形态，并利用草酸铵结晶紫对其进行简单染色后在显微镜下观察其形态特征，初步鉴定菌属。(5) 16s rDNA序列克隆:细菌基因组DNA的提取按照《精编分子生物学实验指南》中的方法进行；使用上游引物5-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物5-TACGGCATCCTTGTTACGACTT-3进行16s rDNA的序列扩增，PCR条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin30s，30个循环；最后72°C延伸lOmin，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测并回收产物，并送去测序。(6)序列比对及系统发育树的构建:将16s rDNA序列测序结果提交GenBank数据库；用Blast软件在GenBank网站上进行相似性搜索，获取相近典型菌株的基因序列；利用Clustalw2在线工具将序列及其相似性序列进行遗传关系研究，并用邻接法构建系统发育树状图。结果与分析菌株筛选 将土壤样品涂布于初筛平板上，待生长出单菌落后，用刚果红染色，可见清晰透明水解圈见图1。菌种形态观察 用草酸铵结晶紫染料于载玻片上对其进行简单染色，并在油镜下观察其形态特征见图2。16s rDNA序列克隆结果 PCR扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳后，获得I条约1500bp大小的特异性DNA条带，见图3。序列比对及系统进化树构建结果 对序列结果进行同源性分析以及Blast比对，与之相似度达99.5%的菌株大部分为蜡状芽孢杆菌，因此确定菌株Hl为蜡样芽孢杆菌见图4。Hl菌株的发酵条件优化及酶活测定 为了优化培养基的配方以提高菌株Hl的产酶量，本专利通过设计正交实验，考察了不同碳源、氮源和PH三个因素在三个不同水平下(见表1)对菌株Hl产酶的影响。采用正交设计助手进行实验设计分析。选用L9 (34)正交表进行实验(见表2)，其中第4列作为误差列，并根据之前对于菌株Hl的产酶监测情况，在接种后第60h对菌株Hl的纤维素酶活力进行测定，并对测定的结果进行分析。表1因素水平表【权利要求】1.一株产纤维素酶菌株H1，其特征本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产纤维素酶菌株H1，其特征在于：所述产纤维素酶菌株H1为芽孢杆菌（Bacillus?sp.)，保藏编号为CGMCC?No.7395。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕暾，黄文斌，黄家俊，冯荣虎，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。