利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法，包括黄瓜子房的取材，消毒，切片，高温诱导处理，继代培养与植株再生等步骤。采用本发明专利技术方法可使植株再生率达到20%，且再生植株中自然加倍而成的双单倍体植株频率达到80%。本方法不仅适用于国内主栽密刺型黄瓜，旱黄瓜类型的黄瓜，还适用于日本类型黄瓜，欧洲类型黄瓜等，经过田间筛选可用作育种材料，应用于黄瓜品种的选育，从而加快育种进程。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种，包括黄瓜子房的取材，消毒，切片，高温诱导处理，继代培养与植株再生等步骤。采用本专利技术方法可使植株再生率达到20%，且再生植株中自然加倍而成的双单倍体植株频率达到80%。本方法不仅适用于国内主栽密刺型黄瓜，旱黄瓜类型的黄瓜，还适用于日本类型黄瓜，欧洲类型黄瓜等，经过田间筛选可用作育种材料，应用于黄瓜品种的选育，从而加快育种进程。【专利说明】
本专利技术涉及组织培养技术，具体地说，涉及一种。
技术介绍
新品种的推广和普及对于推动黄瓜生产的发展发挥了重要作用，选育抗逆性强、兼抗多种病害、能适应各种生态环境、高品质的品种仍将是今后黄瓜育种工作的发展方向。传统的育种方法耗时、耗力、效率低，另外由于种质资源的限制，可供利用的资源性状差异越来越小，因此仅靠常规育种方法和现有资源已难以使新育成品种在抗性、品质方面有很大突破，因而种质资源是育种研究的基础，没有突破性的种质资源，就不可能育成突破性的品种。采用单倍体育种方法进行品种选育弥补了传统育种的诸多不足，成为育种家关注的焦点。单倍体育种是利用花药培养、子房培养以及辐射花粉授粉诱导等方法诱导产生单倍体，并使其单一的染色体各自加倍成对，成为有活力、能正常结实的纯合体。它在遗传上是稳定的，不再分离，相当于同质结合的纯系(而从杂交到获得不分离的品系只需要两个世代的时间)。由于单倍体植株的基因型和表现型完全一致，大大降低了误选频率；而且以单倍体为诱变材料，突变隐性基因性状就可表现出来，获得突变体的速度可大大加快，从而缩短了育种年限，并可以快速产生纯合的育种新材料(纯系)，为提高育种效率提供了可能，还可作为遗传转化的优良受体材料。黄瓜单倍体研究在国外较为成熟，最常见的是利用花药培养的方法。然而，目前黄瓜大孢子单倍体培养技术存在效率低的问题，单倍体发生频率和植株再生频率均较低。
技术实现思路
本专利技术旨在提高单倍体发生频率和植株再生率，提供一种。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种，包括以下步骤:I)取黄瓜植株开花前未授粉的子房，消毒后用无菌水洗净；2)将子房切片，接种于MS固体培养基I中，置于33_36°C (优选35°C)黑暗条件下高温诱导24-72h (优选48h)；3)将上述培养基置于16h光照，8h黑暗的室温条件下继续培养至出现胚状体和愈伤组织；4)将胚状体转移至MS固体培养基II中，置于16h光照，8h黑暗的室温条件下培养，待胚状体长出5-6片叶后，炼苗，定植于大田。其中，步骤2)中所述MS固体培养基I为:MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤lmg/L+萘乙酸 0.5mg/L，pH 值 5.8-6.0 (优选 5.8)。步骤4)中所述MS固体培养基II为:MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸 0.2mg/L，pH 值 5.8-6.0 (优选 5.8)。前述的方法，步骤I)具体为:取黄瓜植株开花前2天未授粉的子房，用75%的酒精消毒30s，然后用0.1%的HgCL2溶液消毒7min，最后用无菌水冲洗3次。前述的方法，步骤2)中是将无菌材料横切成2mm厚的子房切片。前述的方法，步骤3)中使用的光源为光强1500Lux的LED灯光源。前述的方法，步骤4)中使用的光源为光强2000LUX的LED灯光源。本专利技术还提供用于诱导培养黄瓜大孢子单倍体的培养基，所述培养基为:MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤lmg/L+萘乙酸0.5mg/L, pH值5.8-6.0 (优选5.8)。本专利技术还提供用于继代培养黄瓜大孢子单倍体的培养基，所述培养基为:MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L, pH值5.8-6.0 (优选5.8)。本专利技术的中，在培养基中添加了激素成分，且在培养前期进行了高温诱导预处理，采用该方法可使植株再生率达到20%，且再生植株中自然加倍而成的双单倍体植株频率达到80%。本方法不仅适用于国内主栽密刺型黄瓜，旱黄瓜类型的黄瓜，还适用于日本类型黄瓜，欧洲类型黄瓜等，经过田间筛选可用作育种材料，应用于黄瓜品种的选育，从而加快育种进程。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术实施例1中经高温诱导处理后的大孢子在培养30多天后，产生成熟的胚状体。 图2为本专利技术实施例1中胚状体在伸长培养基中的生长。图3为本专利技术实施例1中移栽前对伸长培养基中的再生植株进行炼苗。图4为本专利技术实施例1中采用流式细胞仪鉴定再生植株为单倍体植株。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1I材料来源1.1基因型:国内主栽的密刺类型的黄瓜品种(津优35)，旱黄瓜类型(唐山秋瓜)，日本类型黄瓜(瑞光2号)，欧洲类型的黄瓜(迷你2号)等，共计10个品种。其中，唐山秋瓜是常规种，其他均为杂交种，可市售获得。1.2取材:供体材料种植于温室或大棚，取材要求植株处于生长旺盛的阶段(取材植株生长阶段在10-25节之间)。取开花前2天的未授粉子房。2 消毒选取子房用75%的酒精消毒30s,然后用0.1%的HgCL2消毒7min,最后用无菌水冲洗3次待用。3 接种将无菌材料横切，切成厚度为2mm的子房切片。接种于添加有激素的MS固体培养基中。MS培养基配方为:MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤lmg/L+萘乙酸0.5mg/L, pH值5.8。4高温诱导将接种好的培养皿置于35°C的黑暗条件下高温诱导48h。5胚胎诱导 将上述高温诱导处理后的大孢子培养皿静置培养，培养条件为:白天光强1500LUX的LED灯光源的光照16h。晚上8小时黑暗处理。培养室温度25°C，处理一个月后可见幼小的胚状体和愈伤组织出现(图1)。6继代培养与植株再生挑选健康的胚状体转移到MS伸长培养基中，MS伸长培养基为:MS+3%蔗糖+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L, pH值5.8。培养条件为:白天光强2000LUX的LED灯光源的光照16h。晚上8小时黑暗处理。培养室温度25 °C。7 移栽待胚状体长成5-6片叶(图2)后，经过炼苗(图3)，定植于大田。8染色体倍性鉴定取植株新生叶片，使用流式细胞仪进行染色体的倍性鉴定，并用普通2倍体植株的叶片做对照。熟练操作后，亦可通过明显的田间形态差异进行鉴定，例如，单倍体植株弱小，茎杆细，叶片小，雄花和雌花多早衰；自然加倍后的双倍体植株与正常2倍体植株相同，叶片和茎杆正常，植株健壮，育性恢复，后代性状表现一致，不发生分离。9实施结果9.1胚胎诱导率供试材料共计10个基因型，均能诱导出健壮的胚胎，并在伸长培养基中正常生根发芽伸长生长成长成再生植株，不同基因型的胚诱导率有差异，密刺溜类型的黄瓜品种(中农26、津优35等)胚胎诱导率较高，再生植株率可达到20% (见表1)。日本类型黄瓜和旱黄瓜类型黄瓜胚诱导率和植株再生率次之，欧洲类型的黄瓜，胚诱导率和植株再生率相对较低。表1胚胎诱导率【权利要求】1.，其特征在于，包括以下步骤: 1)取黄瓜植株开花前未授粉的子房，消毒后用无菌水洗净； 2)将子房切片，接种于MS固体培养基I中，置于33-36°C黑暗条件下高温诱导24-72h； 3)将上述培养基置于16h光照，8h黑本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）取黄瓜植株开花前未授粉的子房，消毒后用无菌水洗净；2）将子房切片，接种于MS固体培养基I中，置于33?36℃黑暗条件下高温诱导24?72h；3）将上述培养基置于16h光照，8h黑暗的室温条件下继续培养至出现胚状体和愈伤组织；4）将胚状体转移至MS固体培养基II中，置于16h光照，8h黑暗的室温条件下培养，待胚状体长出5?6片叶后，炼苗，定植于大田；其中，步骤2）中所述MS固体培养基I为：MS+3%蔗糖+6?苄基腺嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L，pH值5.8?6.0；步骤4）中所述MS固体培养基II为：MS+3%蔗糖+6?苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L，pH值5.8?6.0。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立功，张峰，于拴仓，赵泓，王晶，李军，乔雪辉，崔瑾，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：