使用改进的免疫复合物(IC) ELISA来检测抗体制造技术

本发明专利技术涉及诊断或分析方法领域。具体地讲，本发明专利技术人教导了FcγR例如CD16、CD32或CD64可以用于在体外定量测定呈免疫复合物形式的抗体，所述复合物即是由抗原和特异性抗体所形成的复合物。也提供了用于呈免疫复合物形式的抗体的检测和定量测定的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及诊断或分析方法领域。具体地讲，本专利技术人教导了FcγR例如CD16、CD32或CD64可以用于在体外定量测定呈免疫复合物形式的抗体，所述复合物即是由抗原和特异性抗体所形成的复合物。也提供了用于呈免疫复合物形式的抗体的检测和定量测定的方法。【专利说明】使用改进的免疫复合物(IC) ELISA来检测抗体本专利技术涉及诊断或分析方法领域。具体地讲，本专利技术人教导了 Fe Y R例如⑶16、CD32或CD64可以用于在体外定量测定呈免疫复合物(即由抗原和特异性抗体所形成的复合物)形式的抗体。也提供了用于呈免疫复合物形式的抗体的检测和定量测定的方法。在各种出版物中，已经描述了高度灵敏的免疫复合物(IC) ELISA用于针对以下的IgG抗体的检测:巨细胞病毒(Sachers, Emmerich等人，1985)、拉沙病毒衣壳抗原(Emmerich, Thome-Bolduan等人，2006)以及西尼罗(West Nile, WN)病毒和蝶传脑炎(TBE)病毒表面的型特异性抗原(LudolfS，Niedrig 等人，2007; Ludolfs, Reinholz 等人，2009)。后两种测试使用各自的黄病毒的ED3结构域，不再显示使用市售常规ELISA或间接免疫荧光(HF)通常可见的黄病毒之间的交叉反应性。原则上，包被有来自类风湿性关节炎患者的类风湿因子(RF) IgM的板有效结合免疫复合物(IC)，其在含特异性IgG抗体的人血清样品和各自的过氧化物酶标记的抗原(酶标抗原，ELA (Sachers, Emmerich等人，1985)混合后形成。与使用抗原包被的板和带标记的抗人IgG样间接ELISA或IIF的抗体测定相比，IC ELISA被证明具有若干优势。通过添加血清样品和各自的ELA，对于阳性结果需要2个免疫步骤。特异性抗体必须与抗原反应，然后聚集，即免疫复合，IgG抗体与固相上的RF IgM结合。因此，涉及到2个免疫机制。检测IC的方法具有优势，具体地讲，使用IC ELISA时，大大过量的单体IgG (其在使用间接ELISA或IIF测试时通常引起背景反应)不再产生背景染色，并且可采用1:10的低血清稀释。因为过氧化物酶(POD)-标记，低分子量抗原将会聚集，其促进形成具有许多POD分子的大1C。因此，可以使用高稀释的ELA (对于西尼罗和TBE ELA，通常1: ≥ 20000)。这也有助于低背景染色。因为可以以高稀释度应用各种ELA，所以可以加入过量大约100倍的竞争性交叉反应的未标记抗原(Ludolfs, Reinholz等人，2009)。因此，可以增加IC ELISA对选择性表位的特异性。最后，IC ELISA在技术上操作非常简单，因为抗原和抗体可同时应用，并且对测试进行染色前仅需一个孵育和洗涤步骤。WN-和TBE-1C ELISA的高特异性已有文献证明，其使用接受TBE疫苗者和WN感染后的患者的大量血清样品。与IIF或间接ELISA (其中这些样品中的许多都显示出众所周知的交叉反应)相比，在WN IC ELISA中使用TBE样品，未见反应(P/N〈 I)。反之亦然，在TBE IC ELISA中使用WN热恢复期患者的样品，未观察到交叉反应性。(Ludolfs，Niedrig等人，2007; Ludolfs, Reinholz 等人，2009)。人或动物抗体对不同黄病毒的交叉反应性是众所周知的现象。使用针对西尼罗病毒、登革热病毒或TBE病毒的包膜糖蛋白的小鼠或甚至人单克隆抗体，已经鉴定出共有的黄病毒表位。例如，针对西尼罗病毒或登革热病毒的包膜蛋白的80%小鼠单克隆抗体具有交叉反应，仅很少数单克隆抗体，大部分是针对包膜蛋白的ED3结构域(8%)，对所述的病毒具有特异性。高免疫原性ED3是推定的受体结合结构域，并且若干中和单克隆抗体与WN或登革热病毒的ED3结合。使用ED3结构域作为抗原来源，IC ELISA比起大部分常规抗黄病毒的ELISA或IIF具有高得多的特异性。POD-标记的ED3结构域蛋白可以以极高稀释度使用(1:20, 000-1:40, 000)。因此，通过以100倍过量加入异源ED3抗原阻断不想要的特异性，是可能的(Ludolfs, Reinholz等人，2009)。由于过氧化物酶标记,抗原的交联能解释带标记的ED3蛋白的高稀释度，因为生物素标记(其不产生聚集)被证明效率要低得多。在特异性抗体存在下，形成超过300 000 Da且含有很多POD分子的非常大的1C。因此，与固相结合的少数带标记的IC将足以产生强POD信号。然而，过夜孵育是必要的，然后这些大的IC才能逐步替换掉与固相包被的FcR分子结合的非特异性IgG分子。非特异性IgG分子和IC之间的这种竞争可以是特别棘手的，当很多IgG以聚集形式存在于血清样品中时。因此，血清样品的贮存条件可以影响IC ELISA的灵敏度。在4° C贮存未稀释血清或在-20° C冷冻看来都可以容许，而重复冷冻和解冻循环或加热￠0° C)看来就会增加aglgG的比例并且对最佳灵敏度可能是不利的。然而，不得不指出在使用IC ELISA中的某些不利之处:只有在过夜孵育之后才得到足够的测定灵敏度，即足够高的阳性/阴性比。因此，与间接ELISA相比，IC需要相对长的孵育时间。另一方面，尤其对于流行病学研究，通常不需要即刻结果，并且IC ELISA的优点，例如极大地促进高通量测定的简单操作、足够的灵敏度和卓越的特异性，将可能补偿某些次要的不利之处。IC ELISA的另一个主要缺点涉及RF IgM的标准化，所述RF IgM是由来自不同的类风湿性关节炎患者的血清的IgM级分组成。因此，存在于IgM级分的RF IgM的含量和其它IgM抗体的特异性两者，各个批次都是不同的。在得自类风湿性关节炎患者的RF IgM级分中仅有大约10% IgM抗体具有RF活性，而90%则表现出非RF-特异性反应。因此，使用不同批次的RF制品，ELISA难以标准化。这也可导致干扰了在测定中使用的ELA。在结合IC中，对RF具有特异性的人单 克隆抗体可能甚至比总体的人RF IgM更有效。因此，它们可代表一个备选，即使可能有可用度的问题(Duquerroy, Stura等人，2007)。虽然对不同的、潜在的免疫复合物结合分子的活性已经进行了一些研究，但必须牢记在心的是，大多数的这些测定在具有重组表面表达的组织培养细胞中已经进行，然而迄今为止缺乏对与固相结合的可溶性潜在结合分子的数据。本专利技术人因此解决替代方法的问题，以提供用于免疫复合物ELISA的方法，其将避免RF包被的至少部分的不足之处，具体地讲，允许更好的标准化。与RF相比，本专利技术人测试了各种IgG结合分子用于体外试验的适合性，所述IgG结合分子在体内是具有活性的，可检测和消除1C。第一，他们选择补体成分Clq。人Clq是经典补体途径的首个成分，其分子量为大约410-462 kDa。Clq的六聚体球形头部排它地与IgG分子的CH2结构域或IgM的CH3结构域结合。Clq必须与至少2条重链结合，以便改变其构象并活化Clr和Cls。其活化是在与呈IC形式的与多价抗原结合的免疫球蛋白结合之后。也已知它与多种其它的活化物质(包括C-反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·施米茨，P·埃默里希帕洛，
申请(专利权)人：伯恩哈德诺策热带医学研究所，
类型：
国别省市：