用于生产感兴趣的化合物的方法技术

本发明专利技术涉及通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的方法，其中使用的微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。本发明专利技术还涉及微生物宿主细胞，所述微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。本发明专利技术还涉及感兴趣的化合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的方法，其中使用的微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。本专利技术还涉及微生物宿主细胞，所述微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。本专利技术还涉及感兴趣的化合物。【专利说明】
本专利技术涉及通过微生物发酵生产感兴趣化合物的方法，其中使用的微生物宿主细胞的基因组已被修饰，使得所述宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合成酶的产生缺失。本专利技术还涉及其基因组已被修饰的微生物宿主细胞，使得所述微生物宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合成酶的产生缺失。本专利技术还涉及感兴趣的化合物。专利技术背景通过工业规模的微生物发酵产生了数目不断增加的化合物。这种感兴趣的化合物范围从初级和次级代谢产物(例如分别为柠檬酸和抗生素)至蛋白、酶以及甚至完整的微生物(例如以面包酵母或生物质的形式)。在工业规模微生物发酵下，可能出现若干问题，最后导致感兴趣的化合物的产率减少和/或感兴趣的化合物的成本增加。所述问题可例如涉及发酵期间发酵液的粘度、发酵期间的氧传递或不想要的副产物比如草酸盐的形成。在使用某些宿主系统，比如真菌的微生物发酵中遇到的问题是 产生有毒产物，比如真菌毒素。W000/39322描述了提供缺失毒素产生的Aspergillus突变体及其在生产感兴趣的多肽的方法中的用途。其他问题尤其是微生物发酵中遇到的问题有妨碍下游处理期间的产物的过滤以及由于发酵期间由微生物细胞产生的不想要的不可溶的副产物而导致的发酵设备的涂覆(coating)。为了减少发酵期间的问题，可优化针对具体产物的发酵和下游加工条件。但是，这种对每一产物的优化不允许对发酵和下游加工方案标准化。当典型地很多不同的产物在一个设施内生产时，发酵和下游加工方案的标准化导致设施实质上更有效的利用以及因而更有效的生产。因而仍需要用于通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的改进的方法，所述方法允许标准化的发酵方案和改进的下游加工。附图描述图1描绘一般的克隆载体pGBDEL，其用于构建实施例中的缺失载体。pGBDEL包含amdS双向选择标记。图2描绘通过基因替代介导的基因或基因片段缺失对微生物宿主细胞的基因组修饰的一般策略。使用的DNA构建体包含amdS选择标记，其侧翼将被缺失基因的同源区域(5’和3’)(I)。通过在对应的基因组基因座处的双同源重组(X)来整合构建体(2)并替代基因组的基因拷贝(基因替代)(3)。随后，在正向重复(U)上重组去除amdS标记，导致将被缺失的基因或基因片段的精确切除(4)。图3描绘根据图2的缺失策略的改良。这是促使大序列缺失的改良的策略。基因打断的目标区域是基因的5’部分和将被打断的NRPS基因的内部片段。用于去除标记的重复序列含有与将被打断的基因的3’部分同源的序列(I)。这样构建的线性DNA片段在目标序列的同源基因座处通过双交换整合进基因组中，因而由amdS基因置换将被缺失的基因的5’部分(2)。转化后，通过(第二次)同源重组事件，为将被打断的基因的3’部分的产生的正向重复允许去除选择标记(3)，通过所述同源重组事件，缺失了将被去除的基因的额外片段⑷。图4描绘质粒PGBDEL-NRPS，其用于缺失编码NRPS的npsE基因，布局代表其他缺失构建体的质粒。图5描绘质粒pGBTOPPLA-Ι，其用于表达猪磷脂酶A2。图6描绘用过本专利技术的Aspergillus niger菌株产生的酶产物，在啤酒中的诱导喷涌的测试。序列表描沭SEQ ID N0:1描绘了 Aspergillus niger的npsA基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。基因组序列包含根据SEQ ID N0:2的cDNA。SEQ ID NO:2 描绘了 Aspergillus niger npsA 的 cDNA(编码序列)。SEQ ID NO:3 描绘了 Aspergillus niger npsA 的 mRNA 序列。SEQ ID N0:4 描绘了 Aspergillus niger npsA 的蛋白序列。SEQ ID NO: 5 描绘了肽 VVFF 的序列。SEQ ID NO:6 描绘了肽 VVFY 的序列。SEQ ID N0:7描绘了 Aspergillus niger的npsB基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。基因组序列包含根据SEQ ID N0:8的cDNA。SEQ ID NO:8 描绘了 Aspergillus niger npsB 的 cDNA(编码序列)。SEQ ID NO:9 描绘了 Aspergillus niger npsB 的 mRNA 序列。SEQ ID N0:10 描绘了 Aspergillus niger npsB 的蛋白序列。SEQ ID NO: 11描绘了 Aspergillus niger的npsC基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。该基因组序列包含根据SEQ ID N0:12的cDNA。SEQ ID N0:12 描绘了 Aspergillus niger npsC 的 cDNA(编码序列)。SEQ ID N0:13 描绘了 Aspergillus niger npsC 的 mRNA 序列。SEQ ID N0:14 描绘了 Aspergillus niger npsC 的蛋白序列。SEQ ID NO: 15描绘了 Aspergillus niger的npsD基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。基因组序列包含根据SEQ ID N0:16的cDNA。SEQ ID N0:16 描绘了 Aspergillus niger npsD 的 cDNA(编码序列)。SEQ ID N0:17 描绘了 Aspergillus niger npsD 的 mRNA 序列。SEQ ID N0:18 描绘了 Aspergillus niger npsD 的蛋白序列。SEQ ID NO: 19描绘了 Aspergillus niger的npsE基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。基因组序列包含根据SEQ ID N0:20的cDNA。SEQ ID NO:20 描绘了 Aspergillus niger npsE 的 cDNA(编码序列)。SEQ ID NO:21 描绘了 Aspergillus niger npsE 的 mRNA 序列。SEQ ID NO:22 描绘了 Aspergillus niger npsE 的蛋白序列。SEQ ID NO:23 描绘了肽 VVWY 的序列。SEQ ID NO: 24 描绘了肽 VLYW 的序列。SEQ ID NO:25 描绘了肽 VLFY 的序列。SEQ ID NO:26 描绘了肽 LLFY 的序列。SEQ ID NO:27 描绘了肽 VVFW 的序列。SEQ ID NO: 28 描绘了肽 VLFF 的序列。SEQ ID NO:29描绘了密码子优化的Penicillium chrysogenum葡萄糖氧化酶基因的序列。SEQ ID NO:30 描绘了 Penicillium chrysogenum 葡萄糖氧化酶的蛋白序列。SEQ ID NO:31 描绘了 Penicillium chrysogenum本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：诺尔·尼可拉斯·玛利亚·伊丽莎白·佩奇·范，马库斯·汉斯，马帝那·贝舒森，迪克·希珀，罗伯特斯·安东尼厄斯·马金德尔特·霍文·范德，奥利弗·莱昂纳德斯·舒恩，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
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