本发明专利技术涉及用抗原结合蛋白纯化包含人IgG-CH1结构域的分子的方法，所述抗原结合蛋白能结合包含在人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一个的CH1结构域中的表位。本发明专利技术进一步涉及能用于本发明专利技术方法中的抗原结合蛋白。本发明专利技术的抗原结合蛋白的构架区优选相应于天然没有轻链的抗体的那些构架区，例如可以在骆驼中发现的抗体。本发明专利技术进一步涉及编码这种抗原结合蛋白的核酸，包含这种蛋白的免疫吸附材料，及这种免疫吸附材料从各种物质中纯化含有IgG-CH1结构域的分子的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及用抗原结合蛋白纯化包含人IgG-CH1结构域的分子的方法，所述抗原结合蛋白能结合包含在人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4的每一个的CH1结构域中的表位。本专利技术进一步涉及能用于本专利技术方法中的抗原结合蛋白。本专利技术的抗原结合蛋白的构架区优选相应于天然没有轻链的抗体的那些构架区，例如可以在骆驼中发现的抗体。本专利技术进一步涉及编码这种抗原结合蛋白的核酸，包含这种蛋白的免疫吸附材料，及这种免疫吸附材料从各种物质中纯化含有IgG-CH1结构域的分子的用途。【专利说明】针对人IgG抗体的CH1结构域中表位的抗原结合蛋白专利
本专利技术涉及生物化学及免疫学领域，特别是免疫亲和性及抗体技术。本专利技术涉及用能结合人CHl结 构域的抗原结合蛋白捕获包含人IgG-CHl结构域的靶分子的方法。本专利技术进一步涉及用于所述方法中的手段，包括衍生自骆驼(camelid)抗体的抗原结合蛋白，包含这种蛋白的免疫吸附材料及其生产手段和方法。_2] 专利技术背景哺乳动物IgG抗体和/或其Fab片段、特别是人和/或人源化IgG抗体和/或其Fab片段的高效、快速、节约和成本高效的纯化是现有技术中深入研究的问题。随着新的基于抗体药物的出现，IgG和/或其Fab片段的纯化在基于抗体药物生产中变成更关键和昂贵的步骤，需要高纯度。另外，这种治疗性抗体必须保持它们的结合亲和性及生物学活性，包括效应物功能。为了纯化所有4个亚类的人或人源化IgG，即人/人源化IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，常用纯化方法包括使用经典生化分离和纯化技术如阴离子/阳离子交换、大小排阻/凝胶过滤、沉淀及应用特异性亲和性配体。常用亲和性配体是细菌衍生的蛋白A和蛋白G，单克隆抗体及骆驼抗体或者衍生自其中的结合片段，其结合4个亚类人或人源化IgG的一或多个亚类。蛋白A结合人IgGl、人IgG2和人IgG4(Fc)的CH2-CH3界面，因此不能用于纯化人IgG3，因此不能用于所有人IgG亚类。蛋白A显示与VH3家族的一些人VH结构域结合，但是不与人 VHl 和 VH2 结合(Janssonet al (1998) FEMS Immunology and MedicalMicrobiology20:69-78)，因此蛋白A不能用作通用工具纯化所有人IgG衍生的Fab片段。另外，蛋白A不能用于从由人IgG Fe-和Fab片段的混合物组成的原料样品中选择性捕获人IgG衍生的Fab片段，因为其对IgG Fe结构域的结合反应性更突出。另外，基于Z结构域的蛋白A变体(如MabSelect Sure)缺少结合人VH3结构域的能力，因此不能用于Fab纯化。蛋白G是由C和G群链球菌表达的细菌表面蛋白。蛋白G以高亲和性识别在人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4抗体的Fe部分(Fe Y )上CH2和CH3结构域之间界面处的共同位点。另外，蛋白G显示通过结合IgG的CHl结构域组合kappa同种型的CL结构域而结合IgG 抗体的 Fab 部分(Derrick and Wigley (1994) J.Mol.Biol.243:906-918)。蛋白 G 仅结合来自 IgGl、IgG3 和 IgG4 的 Fab,但是不结合 IgG2 的 Fab (Perosa et al (1997) Journalof Immunological Methods203:153-155)。对CHl的结合亲和性显著低于Fe部分上的其表位，这例如反映在必须使用低流速以使得有效纯化人Fab片段(Proudfoot et al.(1992)Protein expression and purifications:368-373) ? 关于蛋白 G 在 CH2 和 CH3 结构域界面的结合，实验数据表明发生诱导契合，其可以解释洗脱所需的严苛条件，如在等于或低于ρΗ2.5 的洗脱 pH所不(PROTEUS, Protein G Antibody Purification Handbook ；Mini&Midispincolumns ；5September2005 ;Pro_Chem, Littleton, USA)。这些严苛条件可影响结合位点的构象，由此改变纯化的IgG抗体的免疫功能(P.Gagnon, 1996, in Purification toolsfor monoclonal antibodies,published by Validated Biosystems,Inc5800N)。X-身寸线晶体测量示出通过结合蛋白A，CH2结构域可以朝CH3结构域纵向移位，其最终导致CH2结构域之间碳水化合物区域的部分旋转及去稳定化。所述变形干扰随后的蛋白质-蛋白质相互作用，这种相互作用是IgG发挥其效应物功能所需的。除了严苛洗脱条件对抗原结合能力的后果(特别是对于蛋白G)，这些二级作用有时干扰或改变抗体效应物功能及增加免疫球蛋白对蛋白酶解的易感性。如果人或人源化抗体用作治疗目的，由变性导致的效应物功能的丧失改变折叠及纯化步骤期间产生的化学修饰是非常不希望的。特别地，分子内及分子间硫桥的还原经常是纯化和储存期间产生的问题。蛋白L经VL kappal、3和4结合人Fab,但是不结合VL kappa2及不结合lambda同种型的任何VL结构域。因此，蛋白L不结合全部人IgG衍生的Fab片段并且不是仅对IgG选择性的。作为人IgG结合蛋白如蛋白G的替代，在文献中已描述一些小鼠单克隆抗体(Mab)能够结合人 IgG 抗体的 Fe 结构域(Nelson PN, et al.Characterisation ofant1-1gG monoclonal antibody A57H by epitope mapping.Biochem Soc Transl997 ；25:373)。已鉴别一些共同Fe表位，例如:Mab G7C、JD312具有在CH2上的结合表位，氨基酸 290-KPREE-294。Mab PNF69C、PNFl IOA、PNF211C 具有在 CH2-CH3 上的结合表位，AA:338-KAKGQPR-344。Mab A57H 显示在 CH3 上的结合表位，AA380-EWESNGQPE-388。与使用小鼠Mab或者来自其它非人物种的Mab相关的问题是Mab从基质释放导致纯化的制备物中的污染很难被除去。另外，Mab及其功能片段(Fab、Fab2)容易变性，对于分子的正确3D结构及重链和轻链排列所需的S-S桥容易被破坏，特别是在经常是释放柱结合人IgG所需的严苛洗脱条件下。由于基于Mab的亲 和性配体的弱点，柱容量快速降低，柱在洗脱后的再利用能力非常有限并且不适合连续操作。代替EP-A-434317所述的(sc) Fv片段，如W02006 / 059904所述的衍生自天然缺乏轻链的抗体的抗体片段(VHH)也可以用于产生免疫吸附材料用于人IgG抗体的纯化。应用这些VHH片段的优势是它们是单结构域肽，甚至在更高温度下也非常稳定。另外，VHH小，容易在节约成本的宿主生物体如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生产。另外，由于这些VHH片段与人VH3结构域家族之间的序列相似本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：W·J·J·赫尔曼斯，S·布洛克兰，M·A·范克斯特伦，J·M·霍勒弗特，F·J·M·德特默斯，
申请(专利权)人：BACIP私人有限公司，
类型：
国别省市：
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