罗丹明B的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒，其中包括罗丹明123特异性抗体、罗丹明123与载体蛋白的偶联物和酶标二抗、包被罗丹明123抗原或特异性抗体的酶标板，罗丹明B标准溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；其中罗丹明123特异性抗体为罗丹明123的多克隆抗体。本发明专利技术的罗丹明B酶联免疫试剂盒中主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便、价格低廉；对样品的前处理要求低且处理过程简单，能同时快速用于大批样品的筛查；与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒，其中包括罗丹明123特异性抗体、罗丹明123与载体蛋白的偶联物和酶标二抗、包被罗丹明123抗原或特异性抗体的酶标板，罗丹明B标准溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；其中罗丹明123特异性抗体为罗丹明123的多克隆抗体。本专利技术的罗丹明B酶联免疫试剂盒中主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便、价格低廉；对样品的前处理要求低且处理过程简单，能同时快速用于大批样品的筛查；与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点。【专利说明】罗丹明B的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法
本专利技术涉及到酶联免疫和食品添加剂残留检测领域。特别是涉及一种用于食品中罗丹明B残留检测的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法。技术背景罗丹明B (Rhodamine B)，中文别名:罗丹明610、玫瑰红B、蕊香红B、玫瑰精B、若丹明B或蓝光碱性蕊香红，分子式C28H31C1N2O3,绿色结晶或红紫色粉末，易溶于水、乙醇，微溶于丙酮、氯仿、盐酸和氢氧化钠溶液。罗丹明B是一种具有鲜桃红色的人工合成的碱性荧光染料，主要用于造纸工业，也可用于腈纶、麻、蚕丝等织物以及麦杆、皮革、羽毛制品的染色。罗丹明B在溶液中有强烈的荧光，常用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。罗丹明B是卫生部首批公布的17种违禁食品添加物质之一。2008年我国将其列入第一批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中，明确规定不允许将其用作食品添加剂及食品染色。罗丹明B属于非食品原料，因其价格低廉、色泽红艳、稳定性强等特点，部分不良商贩将其作为苏丹红替代品用于食用农产品中，如用作调味品(主要是辣椒粉和辣椒油)及染色剂(腊肠等)。实验证明，罗丹明B食用后导致人体皮下组织生肉瘤，具有致癌和致突变性，给社会带来极大危害。目前用于罗丹明B残留检测的方法较多，如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)、气相色谱/质谱联用分析法(GC/MS)、荧光探针法、薄层色谱扫描法、酶联免疫吸附实验(ELISA)等。但常用的理化分析方法需要昂贵的仪器设备、熟练的专业人员等条件，而且操作过程复杂，检测时间较长，故限制了其应用范围，难以在生产实际中推广应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题:克服
技术介绍
中的问题，提供一种特异、灵敏、快速、简便的快速检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒； 还提供了罗丹明B的酶联免疫试剂盒的组建方法和检测方法。本专利技术的技术方案: 一种检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒，其中包括:罗丹明123特异性抗体、罗丹明123与载体蛋白的偶联物和酶标二抗、包被罗丹明123抗原或特异性抗体的酶标板，罗丹明B标准溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；其中罗丹明123特异性抗体为罗丹明123的多克隆抗体。所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔铜蓝蛋白；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶或羊抗兔IgG抗体。所述的洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液，所述终止液为 2mol/L的盐酸。所述的底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述试剂盒还包括浓缩样品稀释液，浓缩样品稀释液为含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液；用于制备酶标板的固相材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。所述罗丹明123与载体蛋白的偶联物是由以下方法得到的: (1)称取3mg的罗丹明123和3mg的琥珀酸酐溶于3mL 0.01 mo I/L pH 7.4的PBS缓冲液中，室温下反应3小时后，向反应液加入7.3 mg 二环己基碳二亚胺和4.5 mg N-轻基琥珀酰亚胺，在4°C反应条件下过夜反应，得到的反应液为A液； (2)称取40mg的牛血清白蛋白溶于2mL 0.01 mo I/L pH 7.4的PBS缓冲液中，得到B液； (3)在室温磁力搅拌下，将A液逐滴加入B液中，4°C反应9h ; (4)用PBS透析3天,换液3次/天；透析完成后，4000r/min离心5min,取上清液,得到罗丹明123与载体蛋白的偶联物。所述罗丹明123的多克隆抗体是由以下方法制备的: 将制得的罗丹明123与载体蛋白的偶联物用生理盐水稀释成lmg/mL的溶液，将其与等量弗氏完全佐剂混合，然后用匀浆仪以20000r/min的转速充分乳化； 选体重在2-3kg的健康雄性新西兰大白兔，用所述的乳化液在大白兔背部皮下多点注射进行首次免疫；每隔2周加强免疫，除用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂外，其他剂量和方法同首次免疫；三免后每次免疫后10天，耳缘静脉采血lmL，进行抗体效价检测；当效价停止继续升高时，直接用免疫原进行最后一次免疫，腿部肌肉注射，第8天颈动脉采集血液，室温凝固2h后4°C过夜，6000r/min离心lOmin，取血清部分用50%的饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33%饱和硫酸铵溶液进行2次沉淀，沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，透析后即得到罗丹明123的多克隆抗体。一种检测罗丹明B酶联免疫试剂盒的组建方法，包括盒体内的罗丹明123多克隆抗体的制备；罗丹明123与载体蛋白偶联物的制备；所述罗丹明123与载体蛋白偶联物的制备方法如下: (1)称取3mg的罗丹明123和3mg的琥珀酸酐溶于3mL 0.01 mo I/L pH 7.4的PBS缓冲液中，室温下反应3小时后，向反应液加入7.3 mg 二环己基碳二亚胺和4.5 mg N-轻基琥珀酰亚胺，在4°C反应条件下过夜反应，得到的反应液为A液； (2)称取40mg的牛血清白蛋白溶于2mL 0.01 mo I/L pH 7.4的PBS缓冲液中，得到B液； (3)在室温磁力搅拌下，将A液逐滴加入B液中，4°C反应9h ； (4)用PBS透析3天,换液3次/天；透析完成后，4000r/min离心5min,取上清液,得到罗丹明123与载体蛋白的偶联物。一种检测样品中罗丹明B含量的方法，包括步骤: (1)样品前处理； (2)用所述的试剂盒进行检测，向包被有罗丹明123抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入罗丹明123多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测吸光度值； (3)分析检测结果。本专利技术试剂盒的检测原理: 由于罗丹明B的化学结构不易合成人工抗原，本专利技术采用罗丹明B的同系物罗丹明123合成人工抗原，制备的罗丹明123抗体能与罗丹明B发生特异性结合，从而达到检测食品中违禁成分罗丹明B的目的。将罗丹明123抗原吸附于固相载体上，加入样本或罗丹明B标准品溶液，并加入抗罗丹明B的罗丹明123多克隆抗体工作液，待测样品中罗丹明B与固相载体上包被的罗丹明123抗体抗原竞争罗丹明123抗体，再加入酶标记抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品吸光度值，该值与样品中罗丹明B的量呈负相关，通过标准曲线比较即可得出罗丹明B的浓度范围。本专利技术的积极有益效果: (I)本专利技术的罗丹明B酶联免疫试剂盒中主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便、价格低廉；与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点。(2)本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒，其中包括：罗丹明123特异性抗体、罗丹明123与载体蛋白的偶联物和酶标二抗、包被罗丹明123抗原或特异性抗体的酶标板，罗丹明B标准溶液、底物显色液、洗涤液、终止液；其中罗丹明123特异性抗体为罗丹明123的多克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张改平，胡骁飞，王栋，张静，职爱民，王方雨，
申请(专利权)人：河南百奥生物工程有限公司，河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：