影响精子功能的唾液酸酶检测方法技术

本发明专利技术提出了一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。该方法是一种新的评估精子质量与功能的实验室检测方法，可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提出了一种。该方法是一种新的评估精子质量与功能的实验室检测方法，可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。【专利说明】
本专利技术属于医疗检测
，具体涉及一种。
技术介绍
随着社会工业的不断发展，不育夫妇的总发病率明显升高。2004年欧洲生殖学会统计:育龄夫妇I年内不能怀孕者占25%，其中15%寻求治疗，男方因素引起不育占50%。男性不育的病因有性功能障碍(1.7% )，精索静脉曲张(12.3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性发育异常(2.1%)后天获得性疾病(2.6% )，内分泌紊乱(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他异常(3%)，但是高达609^75%的患者找不到原因，称为特发性男性不育，他们只表现为少精、弱精或畸形精子症等精子质量异常。不明原因的男性不育可能由于多种因素造成，如长期应激环境因素引起内分泌紊乱、活性氧和基因缺陷等。多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。最主要的原因是常规精液分析只测定精子的数量，存活力，活动率和形态。这些指标只能反映最基本的精液质量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA损伤，精子与人卵透明带结合反应与穿透，顶体状况和反应及与卵黄膜结合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能试验才能测定以上这些功能。精子获能是精卵结合形成受精卵的必要条件，虽然精子获能的相关研究已有一些进展，但仍然存在很多尚未阐明的问题。临床工作中，一部分原发或继发的不育男性病人利用现有的常规精液质量检查项目提示精子及精液质量无异常。目前常用的精子检测手段为CASA(计算机辅助精子分析Computer aided of semen analysis),以及抗精子抗体等。当今最为广泛使用的CASA技术和一些形态学的相关检测，主要能评价精子的活动能力和活精子比率，从而推测其进入女性生殖道的受精能力，而依赖目前的精子功能评价体系，对精子质量及功能的评价存在一定的缺陷，以及难于给病人提供相应的临床咨询`。事实上，这仅仅是评价精子功能的一个方面，我们应该考虑到可能还有影响精子生殖能力的更多没有被揭示的因素。如文献“哺乳类动物精子自身的唾液酸酶参与获能过程中的唾液酸脱落，，(Sialidases on mammalian sperm mediate deciduous sialylationduring capacitation,〈〈The Journal of Biological Chemistry)), 2012 Nov2; 287 (45): 38073-9)，首次报道了精子膜上的唾液酸酶(NEU1/3)是影响精子生殖能力的新因素。唾液酸(sialic acid)在小鼠及人的体外获能过程中以单个糖分子的方式从精子的细胞膜上脱落，而与此同时，精子膜上的唾液酸酶(NEU1/3)可能由于精子膜的流动性而脱落参与剪切致单个唾液酸分子脱落，文献证实了抑制NEU3的活性会降低精子的获能过程中磷酸化ErK的表达，以及少量不明原因性不育的病人精子这两种酶的低表达。文献虽然提出了唾液酸酶可用于评价精子功能，并公开了小鼠和少量人冰冻精子中唾液酸酶的检测方法。但文献只公开了唾液酸酶在精子中的表达检测，并没有对唾液酸酶的活性检测作进一步报道；并且，所公开的表达检测方法无法顺利检测出新鲜精子中的唾液酸酶，还不能适用于临床应用。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述技术问题，提出了一种。该方法是一种新的评估精子质量与功能的实验室检测方法，可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。 为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下的技术方案: ，其特征在于:第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中闻表达，则进行第_ 步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。所述的体外获能液为HSA (人血清白蛋白)5mg/ml HTF (人输卵管液)。所述的第一步，按照下述步骤，分别进行精子唾液酸酶NEUl和NEU3的表达检测: A收集新鲜液化精液标本，低速离心分离出精子，PBS (磷酸缓冲液)洗涤精子，充分除去残留的精浆成分； B计数精子数量，冰上置2(T30 min，用于制动精子，便于后续的操作；` C采用0.1%的Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)对精子进行预处理，PBS洗涤精子后，用3%的PFA (多聚甲醛)再次对精子进行预处理； D当检测NEUl时，采用1%的BSA (牛血清白蛋白)-PBS溶液进行封闭；或者，当检测NEU3时，采用甲醇固定； E采用lug/ul的抗人NEUl抗体孵育广3 h，充分保证抗原-抗体结合时间，PBS洗涤精子； F在常温下，精子在1:1000的常规荧光二抗中孵育广2 h ； G采用流式细胞仪检测或荧光显微镜制作精子的细胞涂片，观察唾液酸酶在精子中的表达。所述的第二步，具体操作步骤如下: A新鲜液化精液标本收集，低速离心分离精子，保持精子完整性与活力； B采用上游法，在5%的CO2细胞培养箱中培养精子，收获上游精子，进一步获取活力优良的精子，采用Bffff (Biggers, Whitten, and Whittinghamreedit)培养液洗漆精子，充分去除精浆中残留的蛋白等成分，避免增加非特异性荧光背景和去除一些“去获能因子”。由于精子死后会释放唾液酸酶，干扰实验增加非特异性表达，采用上游法可保证活力良好的精子获能，避免死精子。C计数精子数量，用体外获能液HAS 5mg/ml HTF,在5%的CO2细胞培养箱中孵育精子3-4 h ； D先将经上述操作得到的溶液离心分离，收取的上清液再次离心分离，收取上清液，充分去除精子等有形成分，避免增加非特异性荧光背景； E立即将获能后的上清液用荧光法检测唾液酸酶活性。所述第一、二步的A步骤，以500飞00 g/min的速度低速离心5?6min,以保证精子形态完整，与精浆分离。所述第二步的B步骤，采用上游法于36?37 1:下，在5%的CO2细胞培养箱中培养10?30min。所述第二步的C步骤，计数精子数量，调整为IXlOVml以上，既保证足够的接近生理的体外获能环境，又使其唾液酸酶活性能够被检测； 所述第二步的C步骤，用体外获能液HAS 5mg/ml HTF于36?37 °C下，5%的CO2细胞培养箱中孵育:T4 h，反应体积10(T200ul。因为精子的酶活性相对细菌非常低，所以为了保证的灵敏度，必须控制反应体积为10(T200ul，既保证获能又保证酶的可测的浓度。所述第二步的D步骤，本文档来自技高网...

【技术保护点】
影响精子功能的唾液酸酶检测方法，其特征在于：第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马芳，许文明，徐克惠，岳焕勋，蒋敏，欧阳运薇，林丽，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：