本发明专利技术公开了一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法。本发明专利技术所述检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，包括：（1）含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；（2）含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。本发明专利技术提供的质粒分子标准品、检测方法及用于检测数据校正的回归方程能够很方便、精确地检测线粒体DNA中的A3243G杂合突变率，具有高效、灵敏的优点，而且对于突变率低于5%的杂合突变也可以精确、定量地检出，这是现有的其他突变检测手段所不具备的独特优点。本发明专利技术也为科研和生产实践上其他的杂合突变定量检测提供了很好的借鉴意义。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法。本专利技术所述检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，包括：（1）含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；（2）含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。本专利技术提供的质粒分子标准品、检测方法及用于检测数据校正的回归方程能够很方便、精确地检测线粒体DNA中的A3243G杂合突变率，具有高效、灵敏的优点，而且对于突变率低于5%的杂合突变也可以精确、定量地检出，这是现有的其他突变检测手段所不具备的独特优点。本专利技术也为科研和生产实践上其他的杂合突变定量检测提供了很好的借鉴意义。【专利说明】一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及生物医学工程领域，具体涉及一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
A3243G突变是线粒体基因组DNA(mito-chondrial DNA, mtDNA)上最常见的致病突变，其常以杂合形式存在，即在一个细胞中既存在野生型的mtDNA，也存在突变型的mtDNA。A3243G突变是早发性糖尿病及神经性耳聋等疾病的致病因素之一，A3243G突变率与其引起临床症状的轻重程度相关。因此，对于A3243G突变的准确定量检测具有非常重要的意义。mtDNA3243位点处于16S rRNA与tRNALeu(UUR)基因交界处，对mtDNA3243位点A/G突变的研究发现A碱基位于tR NALeu (UUR) 二级结构的双氢尿嗜陡环上，在进化中高度保守。该位点的突变可能会使tRNALw(UUR)正常的立体结构发生改变，从而影响到多肽链合成中亮氨酸的掺入。目前常用的突变检测方法主要有PCR-RFLP、PCR-SSCP, PCR-测序等，但是这些方法的检测灵敏度较低，并且对于突变率〈5%的杂合突变一般无法检出。由于应用上的需求，目前急需开发一种新的用于定量检测杂合突变的方法及检测用试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对目前缺少定量检测线粒体A3243G杂合突变率的检测标准品以及现有的对于A3243G突变的检测方法不够灵敏的现状，提供一种灵敏度更高的A3243G突变检测方法和在定量检测中使用的标准品及其试剂盒。本专利技术解决上述技术问题的技术方案之一为:一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，包括:(I)含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；和(2)含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。本专利技术中，所述的3243位点是指人线粒体基因组DNA的第3243位核苷酸。在正常人的线粒体基因组DNA中，mt3243位点为A，病人mtDNA中常常会突变为G。本专利技术中，所述的含3243位点的线粒体DNA片段是指包括了 3243位点的线粒体基因组DNA片段。优选的，所述的3243位点为野生型A的线粒体DNA片段长度为50-1OOObp，更优选53bp ；3243位点为突变型G的线粒体DNA片段长度为50_1000bp，更优选53bp。最优选的，所述的3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本专利技术中，所述的载体可以是任何常规载体，如质粒、粘粒(pHZ132)、噬菌体或病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等。优选的，所述的载体是质粒。更优选的，所述的载体是T-载体。更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，如pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pUC19，pBlueScriptll SK或pGEM系列载体。最优选的，所述的载体是pGEM_T载体。本专利技术中，优选的，所述的含3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体和含3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体组成混合物。优选的，所述的混合物中含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体的含量占载体总量的O-100%中的任一浓度，含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体的含量为余量，所述的混合物之间形成一系列载体浓度比例梯度。更优选的，所述的混合物中含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体的含量分别占载体总量2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%，含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体的含量为余量。进一步优选的，所述的混合物中还包括溶解载体的介质，所述的介质是任何可以溶解载体的溶剂，较佳的包括水、TE、PBS或者生理盐水。更优选的，所述的混合物中，所述的载体在介质中的浓度为各种可用的浓度，可以是Ing/ μ L-1OOng/ μ L,优选50ng/ μ L。本专利技术解决上述技术问题的技术方案之二为:一种检测线粒体A3243G杂合突变率的试剂盒，包括所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品。其中，所述的标准品如上所述。 优选的，所述试剂盒中还包括扩增含3243位点的线粒体DNA片段的扩增引物和用于检测含3243位点的线粒体DNA片段的焦磷酸测序引物中的一种或两种。所述的扩增引物是长度为25±15nt的寡核苷酸链，其与线粒体基因组DNA片段完全相同或互补，所述的扩增引物只要是能够扩增含3243位点的线粒体DNA片段即可。较佳的，所述的扩增引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。所述的焦磷酸测序引物与线粒体基因组DNA片段序列完全相同，只需位于3243位点上游即可，优选SEQ ID N0.5所示的引物。优选的，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂和/或TE缓冲液。优选的，所述试剂盒中还包括说明书。该说明书记载了该试剂盒的使用方法，即定量检测线粒体A3243G杂合突变率的方法，该方法包括以下步骤:I)以上述不同百分比的标准品为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；2)对步骤I)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；3)根据步骤2)中焦磷酸测序的结果拟定用于数据校正的回归方程；4)从待检样本中提取DNA;5)以步骤4)所得的DNA为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；6)对步骤5)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；7)对步骤6)所得的测序结果应用步骤3)所得的回归方程进行数据校正，即得待检样本的线粒体A3243G杂合突变率。本专利技术中，所述的焦磷酸测序是本领域常规的焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须进行荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息，在峰值图上显示的峰值高度可以检测出混合DNA模板中等位基因的频率。但是本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，其特征在于，包括：（1）含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；和（2）含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾溢滔，颜景斌，曾凡一，方彧聃，
申请(专利权)人：上海市儿童医院，上海凡翼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。