本发明专利技术公开了一种新型细胞因子融合蛋白——趋化因子干扰素诱导蛋白10单链抗体的制备方法，包括以下步骤：S1、合成人源性IP10胞外端基因；S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III（EGFRvIII）的单链抗体；S3、对(Gly4Ser)3柔性接头进行优化合成；S4、将IP10和抗EGFRvIII单链抗体依次克隆于真核表达载体中，并通过优化的(Gly4Ser)3柔性接头连接，获得IP10-scFv基因；S5、将该基因在大肠杆菌中高效表达，获得生物学活性的IP10-scFv。本发明专利技术的IP10-scFv具有更高的抗原-抗体结合率，临床上可以减少IP10用量，降低其毒副作用，进而还可以减少胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）过继输入的数量和提高CTL活性。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种新型细胞因子融合蛋白——趋化因子干扰素诱导蛋白10单链抗体的制备方法，包括以下步骤：S1、合成人源性IP10胞外端基因；S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III（EGFRvIII）的单链抗体；S3、对(Gly4Ser)3柔性接头进行优化合成；S4、将IP10和抗EGFRvIII单链抗体依次克隆于真核表达载体中，并通过优化的(Gly4Ser)3柔性接头连接，获得IP10-scFv基因；S5、将该基因在大肠杆菌中高效表达，获得生物学活性的IP10-scFv。本专利技术的IP10-scFv具有更高的抗原-抗体结合率，临床上可以减少IP10用量，降低其毒副作用，进而还可以减少胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）过继输入的数量和提高CTL活性。【专利说明】一种新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法
本专利技术属于医学领域，具体涉及一种新型细胞因子融合蛋白一趋化因子干扰素诱导蛋白10 (IPlO)单链抗体的制备方法，及其体内活性检测方法。
技术介绍
尽管有手术、放疗和化疗等综合治疗手段，在过去20多年，恶性脑胶质瘤特别是多形胶质母细胞瘤的预后并无明显改善，免疫治疗通过激发和补充机体的抗肿瘤免疫能力来杀灭肿瘤细胞，具有特异性强、毒副反应轻和长期记忆等特点，对于靶向清除侵润的残余肿瘤细胞是一种较理想的辅助治疗策略。过去认为中枢神经系统是免疫豁免区，免疫治疗难以奏效，但近年来越来越多的证据提示中枢神经系统并非免疫豁免区，有研究证实被激活的淋巴细胞可以穿过血脑屏障(Sehgal A, Berger MS.Basic concepts of immunologyand neuroimmunology.Neurosurg Focus.2000, 9(6): 1-6)。这使针对胶质瘤的免疫辅助治疗成为可能。随着胶质瘤特异性抗原被相继发现和鉴定，胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)过继疗法成为最令人瞩目的生物治疗研究领域之一。多年来对脑胶质瘤免疫治疗的研究发现动物实验和临床疗效欠佳，其主要原因为靶向募集到脑胶质瘤细胞部位的胶质瘤特异性CTL的细胞数量有限。IPlO属于CXC类的趋化因子，不但具有抗肿瘤血管作用，而且可以定向募集T淋巴细胞并促进淋巴细胞活化和增殖，引起肿瘤内淋巴细胞浸润，显示出强大的抗肿瘤潜力。近年来有 研究表明过继肿瘤抗原特异性CTL能够介导有效的抗神经系统肿瘤免疫效应，其中趋化因子IPlO发挥了关键作用(Nishimura F，Dusak JE, Eguchi J, etal.Adoptive Transfer of Type I CTL Mediates Effective Ant1-Central NervousSystem Tumor Response: Critical Roles of IFN-1nducible Protein-10.CancerRes.2006, 66:4478-4487)。经典的树突状细胞(DC)与肿瘤裂解产物混合培养制备CTL在体内由于肿瘤免疫逃逸机制以及肿瘤免疫原性低等原因，其杀伤作用受到较大限制(RiddellSR.Engineering antitumor immunity by T-cell adoptive immunotherapy.HematologyAm Soc Hematol Educ Program.2007，2007:250-256)。因此，借助 IPlO 的趋化作用，CTL 即可从注射部位靶向富集到肿瘤周围特别是浸润的肿瘤细胞周围。IPlO靶向募集足够数量胶质瘤特异性CTL到胶质瘤细胞部位的前提是胶质瘤细胞部位(而非IPlO肿瘤注射部位)要有足够浓度的IP10。目前主要通过转基因技术或者直接肿瘤局部多点注射等方法使肿瘤富集IP10，前者存在靶向性问题，后者仅能提高注射部位的浓度，而不能选择性提高肿瘤细胞部位特别是浸润于脑组织的肿瘤细胞部位的IPlO浓度，不适合用于辅助治疗这种具有侵袭性生长特性的胶质瘤。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术不能有效在肿瘤细胞部位富集IPio的问题，提供一种针对脑胶质瘤的新型特异性细胞因子融合蛋白一一IPlO单链抗体(IPlO-scFv)，其不仅可以特异性靶向结合脑胶质瘤细胞，而且可以激活体内的淋巴细胞定向募集到胶质瘤细胞周围，参与歼灭肿瘤细胞，对临床上胶质瘤的治疗和预防其复发起到根本作用。本专利技术第一方面提供了一种新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤:S1、根据基因库合成人源性IPlO胞外端编码基因；S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体，并测定其基因序列；S3、对(Gly4Ser) 3柔性接头进行胸腺嘧啶_腺嘌呤序列替换部分鸟嘌呤_胞嘧啶序列的优化合成，并克隆于真核表达载体中；S4、将所述IPlO胞外端编码基因和抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因依次克隆于所述真核表达载体中，并通过所述优化合成的(Gly4Ser)3柔性接头相连接，获得IPlO单链抗体的编码基 因；S5、将所述IPlO单链抗体的编码基因在大肠杆菌中表达，获得IPlO单链抗体。在根据本专利技术第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，所述步骤S I包括:S1-1、根据基因库查找到人源性IPlO的基因序列，通过人工基因合成的方式，合成IPlO的胞外端编码基因；S1-2、将步骤Sl-1获得的人源性IPlO胞外端编码基因克隆入T载体。在根据本专利技术第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，所述步骤S2包括:S2-1、取表皮生长因子受体突变体III免疫小鼠脾淋巴细胞，应用RT-PCR方法分别扩增小鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因，用重叠延伸连接法将编码(Gly4Ser)3柔性接头的接头序列连接所述重链可变区和轻链可变区基因，并克隆入噬粒载体PCANTAB5E，得到重组噬粒；S2-2、以所述重组噬粒转化大肠杆菌TGl细胞，与辅助噬菌体M13K07体内重组，构建噬菌体单链抗体库；S2-3、用表皮生长因子受体突变体III抗原在所述噬菌体单链抗体库中筛选出高结合力的阳性重组噬菌体，并对所筛选阳性重组噬菌体的单链抗体基因片段进行克隆和序列测定，获得抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因序列。在根据本专利技术第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，所述步骤S3包括:S3-1、合成扣17436103柔性接头的肽段，用胸腺嘧啶-腺嘌呤序列替换部分重复率较高的鸟嘌呤-胞嘧啶序列；S3-2、在肽段的3’端加入多聚组氨酸标签序列及限制性内切酶Xhol I和EcoR I位点；S3-3、进行PCR反应，参数为:以94° C预变性3-5分钟、94° C变性30-60秒、50-58° C退火I分钟、70-73° C延伸I分钟为一次循环，进行30-34个循环，70-72° C延伸5-10分钟；S3-4、PCR产物经Xhol I/EcoR I双酶切后，回收并克隆入重组质粒pcDNA3中。在根据本专利技术第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1、根据基因库合成人源性IP10胞外端编码基因；S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体，并测定其基因序列；S3、对(Gly4Ser)3柔性接头进行胸腺嘧啶?腺嘌呤序列替换部分鸟嘌呤?胞嘧啶序列的优化合成，并克隆于真核表达载体中；S4、将所述IP10胞外端编码基因和抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因依次克隆于所述真核表达载体中，并通过所述优化合成的(Gly4Ser)3柔性接头相连接，获得IP10单链抗体的编码基因；S5、将所述IP10单链抗体的编码基因在大肠杆菌中表达，获得IP10单链抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢小玲，赵永祥，王旋，姜晓兵，
申请(专利权)人：卢小玲，赵永祥，
类型：发明
国别省市：
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