本发明专利技术提供了一种固氮基因簇，包含nifB，nifH，nifD，nifK，nifE，nifN，nifX，moeB，nifV9个基因，是目前发现的较小的能够完成固氮功能的基因簇。本发明专利技术还提供了含有上述固氮基因簇基因的表达载体及含有该载体的基因工程菌，本发明专利技术的固氮基因簇可以在大肠杆菌中完成固氮过程，得到的基因工程菌具有较高的固氮能力，且能够解除铵氧对固氮影响。本发明专利技术提供的固氮基因簇可用于制备转基因农作物，提高农作物的生物固氮能力。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种固氮基因簇，包含nifB，nifH，nifD，nifK，nifE，nifN，nifX，moeB，nifV9个基因，是目前发现的较小的能够完成固氮功能的基因簇。本专利技术还提供了含有上述固氮基因簇基因的表达载体及含有该载体的基因工程菌，本专利技术的固氮基因簇可以在大肠杆菌中完成固氮过程，得到的基因工程菌具有较高的固氮能力，且能够解除铵氧对固氮影响。本专利技术提供的固氮基因簇可用于制备转基因农作物，提高农作物的生物固氮能力。【专利说明】一种固氮基因簇及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种具有固氮能力的固氮基因簇nifBHDKENXV moeB 及其应用。
技术介绍
氮是生物生存所必需的重要元素之一。在生物界动物、植物不能直接利用大气中的氮气，只能利用化合态氮。但某些微生物可以直接利用占大气近80 %的氮气，具有将氮气转化成氨的能力即生物固氮。它们能通过体内一种具有特殊催化能力的蛋白质即固氮酶的活动，把空气中的氮转化为植物能吸收利用的含氮化合物。植物从土壤中吸取这些养料用以合成蛋白质，动物又从植物那里摄取蛋白质和其他必需的成分来延续自己的生命活动。由此可见，世界上各种含氮化合物包括蛋白质在内，其最初来源都是空气中的氮，而且都是通过微生物的固氮活动把它转变为有效氮素。所以生物固氮构成了自然界整个氮素循环的重要环节，并直接关系到植物、动物以至人类的生存。生物固氮是个十分复杂的生理生化过程，涉及到固氮酶的生物合成、组装、酶催化、调控等等一系列生化过成。固氮酶系统在结构上和催化机理方面都是相当复杂的，要形成一个具有活性的固氮酶复合体，需要许多基因来编码。肺炎克氏杆菌(Klebesielapneumoniae) 21个固氮基因在染色体上以基因簇的形式存在，全长大约24kb。21个基因构成 8 个转录单位:nifJC, nifHDKTY, nifENX, nifUSVff, nifZM, nifF, nifLA 和 nifBQ。固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501染色体上有56个与固氮相关基因以基因簇的形式存在，棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的nif基因位于两个不相邻的基因族，nifHDKTYENXUSVffZMF 和 nifLABQ。巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)固氮相关基因主要分布在两个基因簇:一个主要nif簇含有nifHDK、nifY、nifE、nifUS、nifff和fixABCX,另外一个nif基因簇由nifA和nifB基因组成。这些G-固氮菌的nif启动子均属于O 54型启动子，其转录严格根`据铵和氧浓度受转录激活蛋白NifA的调控。螺旋杆菌(Heliobacterium)有 I 个 10kb、含 11 个基因的固氮基因族:nifll nif 12 nifH nifD nifKnifE nifN nifX fdx nifB nifV,丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)固氮基因族由 9 个基因组成:nifH nifll nif 12 nifD nifK nifE nifN-B nifVw nifVa ;贝氏梭状芽胞杆菌固氮基因族有 14个基因:nifH nifll nif 12 nifD nifK nifE nifN-B fdxA nirjl nirJ2 nirDnirH nifVw nifVa ;巴氏芽抱梭菌(C.pasteurianum)固氮基因族有10个基因:nifH2 nifHlnifD nifK nifE nifN-B modA modB nifVw nifVa。固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus)目前报道有17个固氮菌种，其抗逆力强、耐贮藏，很多菌株除了有固氮能力外还有促生，抗生等多种能力，其具有独特的基因类型、不一样的固氮调控机理以及潜在的应用价值，因此研究其固氮基因簇有利于研究固氮调节机理，对得到更好、更多的转基因材料具有重要的研究意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株具有固氮基因簇的芽孢杆菌。本专利技术的另一目的在于提供含有上述固氮基因簇的表达载体。本专利技术的再一目的在于提供上述固氮基因簇的应用。本专利技术提供的一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) 18WLY，其含有固氮基因簇nifBHDKENXV moeB。该菌株已于2013年6月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为Paenibacillus sp.，保藏号为CGMCC N0.7724。本专利技术提供的固氮基因簇，其为nifBHDKENXV moeB，核苷酸序列为:(I)SEQ ID N0.10 所示，包含 nifB，nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, moeB,nifV9个基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1_9所示；*(2)SEQ ID N0.10所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或(3)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述严格条件为在0.1XSSC (成分为NaC10.015M，柠檬酸钠0.0015M，PH7.0)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。序列表中SEQ ID N0.1是由15 01个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.2是由867个碱基对组成，编码固氮酶的Fe蛋白。SEQ ID N0.3是由1449个碱基对组成，编码固氮酶的钥铁蛋白的a亚基。SEQ ID N0.4是由1449个碱基对组成，编码固氮酶钥铁蛋白的P亚基。SEQ ID N0.5是由1362个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.6是由1212个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.7是由390个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.8是由1147个碱基对组成，编码产物参与高柠檬酸铁的合成。SEQ ID N0.9是由894个碱基对组成，编码产物参与FeMoco辅因子的合成。SEQ ID N0.10是基因簇在整个基因组中的序列，由11039bp的核苷酸对组成。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本专利技术固氮基因簇基因基因还包括由SEQ ID N0.1-9所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码固氮相关的核苷酸序列。可将本专利技术基因簇与表达载体可操作地连接，得到能够表达本专利技术蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本专利技术有固氮能力的基因工程菌。本专利技术提供了含有上述固氮基因簇nifBHDKENXV moeB的表达载体。在本专利技术实施例中，分别将固氮基因簇插入到表达载体pUC18，pHY300PLK和pET28b上构建得到重组表达载体pUC18-l、pHY300PLK-2、pET28b-3，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株类芽孢杆菌（Paenibacillus?sp.）18WLY，其保藏编号为CGMCC?No.7724。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈三凤，王莉瑛，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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