编码乙型肝炎病毒核心蛋白的核酸分子和包含其的疫苗制造技术

本文提供编码HBV核心蛋白的新型共有氨基酸序列的核酸序列，以及表达所述蛋白质序列的基因构建体/载体和疫苗。本文还提供使用所提供的所述核酸序列来产生针对HBV的免疫反应的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编码乙型肝炎病毒核心蛋白的核酸分子和包含其的疫苗专利
本专利技术涉及编码乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白及其片段的核酸序列；涉及乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白及其片段、涉及改进的HBV疫苗、用于诱导针对HBV的免疫反应的改进方法以及用于预防地和/或治疗地使个体针对HBV免疫的改进方法。专利技术背景本申请要求2011年2月11日提交的美国临时专利申请号61/442,162的优先权，所述专利申请以引用方式并入本文。乙型肝炎是全球范围内流行的常见感染，其导致了肝硬化、肝功能衰竭以及肝细胞癌的发展。显著数量的肝炎病例未被报道出来是因为所述疾病的无症状特性。虽然如此，每年仍报道了约3.5亿慢性乙型肝炎病例。大部分肝炎感染的人群是在不发达国家或者发展中国家。所述病毒基于其包膜蛋白上存在的抗原表位而被分为四种主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)。根据基因组序列的变化，HBV存在至少八种基因型(A-H)。HBV的替代基因型具有流行的地理分布。表1是HBV基因型的地理分布。表1-HBV的地理分布医学病毒学杂志(J.Med.Virol)，DOI10.1002jmvHBV基因组是环形DNA分子，所述分子主要是双链但该双链具有由比另一链更长的一链产生的单链区域。所述双链区域由约3020个核苷酸的较短链的一条链与约3320个核苷酸的较长链杂交而产生。在所述较长链的非杂交核苷酸上的单链区域与HBVDNA聚合酶相缔合。HBV基因组DNA和HBVDNA聚合酶两者都包含在由多个HBV核心蛋白(HBcAg)分子形成的核蛋白壳内。HBV核心蛋白由HBV表面蛋白质(HBsAgs)和脂质分子包膜。所述HBV基因组含有四个开放阅读框架(ORF)：1)编码HBVDNA聚合酶的ORF，2)具有两个起始密码子的ORF，其中连接到第二个起始密码子的序列编码核心蛋白并且包括另一个上游起始密码子的序列编码被称为pre-C的序列；3)具有三个起始密码子的ORF，其中一个编码表面蛋白质(gp27)、一个包括编码被称为pre-S2(gp36)的序列的上游起始密码子，并且另一个包括编码被称为pre-S1(gp42)的序列的更上游的起始密码子；以及4)编码HBxAg的ORF，所述HBxAg是功能较少被了解的蛋白质。用于HBV感染的预防疫苗和治疗涉及注射从慢性携带者的血浆中纯化的亚病毒颗粒或在稳定转染的真核细胞系中作为重组蛋白质而被产生的亚病毒颗粒。所述亚病毒颗粒是病毒蛋白质，并且这些疫苗通常被称为亚单位疫苗。HBV蛋白被施用给个体并变为个体的免疫系统的靶标。在未感染的个体中，针对亚单位疫苗的免疫反应保护所述未感染个体免受HBV感染。在感染个体中，由疫苗诱导的免疫反应可以具有治疗效果。奇萨利·F.V.(ChisariF.V.)，美国病理学杂志(AmJPathol.)，2000.156:1117-1132和帕巴斯·P.(PumpeusP.)等国际病毒学(Intervirology)2001.44:98-114公开了HBV基因组结构。迪奈·P.(DenyP.)和F.·邹莉(F.Zoulim)，病理学与生物学(PathologieBiologie)2010，8月，58(4):24553讨论了乙型肝炎病毒的诊断和治疗。麦克·M.L.(MichelM.L.)和P.·蒂奥莱(P.Tiollais)，病理学与生物学2010，8月，58(4):28895讨论了乙型肝炎疫苗以及它们的保护功效和治疗潜能。PCT公布W02004026899公开了含有具有HBV氨基酸序列的多肽序列的免疫原的用途。PCT公布的申请W02008093976公开了包括包含重组全长HBV表面抗原和HBV核心抗原的疫苗的HBV编码序列、蛋白质和疫苗。整个HBV表面抗原由三种类型的表面蛋白质(L蛋白、M蛋白和S蛋白)组成。PCT公布的申请W02009130588公开了包括编码乙型肝炎病毒核心抗原的核酸的HBV编码序列、蛋白质和疫苗，所述核酸是被优化来用于在人中表达的密码子。PCT公布W02010127115公开了使用重组载体递送HBV序列。可用的HBV疫苗已经表现出了一些功效，但生产昂贵。此外，来源于血浆的亚单位疫苗还具有关于安全性方面的担忧。已经研究了若干疫苗方法，所述方法包括基于重组活载体、合成肽以及包含HBV蛋白质的密码子优化编码序列的DNA疫苗的那些方法。这些其它的方法迄今已具有改变的有限功效。此外，由于基因组的差异，一些HBV疫苗已经在一些地理区域内表现积极的功效并在其它区域内表现有限的功效。已经研究直接施用核酸序列来针对动物和人疾病进行疫苗接种，并且很多努力集中在核酸递送的有效且高效的手段上，以便产生所需抗原的必要表达，从而引起免疫原性反应和最终这个技术的成功。DNA疫苗允许内源性抗原合成，这诱导CD8+组织相容性的复杂的I类受限的细胞毒性T淋巴细胞，所述淋巴细胞用亚单位疫苗很少获得。此外，一段持续的时期内发生的抗原合成可以有助于克服低响应性并除去或减少强化注射的需要。另外，DNA疫苗似乎非常稳定且生产简单。此外，可以通过结合策略如密码子优化、RNA优化和添加免疫球蛋白前导序列来诱导更广泛的细胞免疫反应。DNA疫苗安全、稳定、易于生产，并且在人中耐受良好，其中临床前实验指示几乎没有质粒整合迹象[马丁·T.(Martin,T.)等，质粒DNA疟疾疫苗：肌肉内注射之后基因组整合的可能性。(PlasmidDNAmalariavaccine:thepotentialforgenomicintegrationafterintramuscularinjection.)人类基因治疗(HumGeneTher)，1999.10(5):759-68页；尼克尔斯·W.W.(Nichols,W.W.)等，可能的DNA疫苗整合到宿主细胞基因组中。(PotentialDNAvaccineintegrationintohostcellgenome.)纽约科学院学术年报(AnnNYAcadSci)，1995.772:30-9页]。此外，DNA疫苗非常适合用于重复施用，这是因为这样的事实，即疫苗的功效不受预先存在的对载体的抗体滴度的影响[常特谷·M.(Chattergoon,M.)、J.·泊伊尔(J.Boyer)和D.B.·维纳(D.B.Weiner),基因免疫：疫苗和免疫治疗的新时代。(Geneticimmunization:anewerainvaccinesandimmunetherapeutics.)美国实验生物学学会联合会杂志(FASEBJ)，1997.11(10):753-63页]。然而，对于临床上采用DNA疫苗的一个主要障碍是当移动到较大动物身上时平台的免疫原性减小[刘·M.A.(Liu,M.A.)和J.B.·厄尔默(J.B.Ulmer)，质粒DNA疫苗的人临床实验。(HumanclinicaltrialsofplasmidDNAvaccines.)遗传学进展(AdvGenet)，2005.55:25-40页]。在DNA疫苗免疫原的工程方面的最近的技术进步已经改善了DNA疫苗的表达和免疫原性，这些技术如密码子优化、RNA优化和免疫球蛋白前导序列的添加[安德烈·S.(Andre,S.)等，通过用具有优化密码子使用的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.11 US 61/442,1621.一种核酸分子，所述核酸分子编码在个体中诱导免疫反应的共有HBV核心蛋白的序列，所述蛋白是：SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的蛋白质。2.如权利要求1所述的核酸分子，其进一步包含一条核酸序列，所述序列编码连接至所述蛋白质的N端的信号肽。3.如权利要求1所述的核酸分子，其编码SEQIDNO:2的蛋白质。4.如权利要求1所述的核酸分子，其核苷酸序列是SEQIDNO:1。5.如权利要求1所述的核酸分子，其进一步包含一条核酸序列，所述序列编码连接至所述蛋白质序列的5’端的信号肽。6.如权利要求1所述的核酸分子，其核苷酸序列是选自由以下组成的组的一个或多个核苷酸序列：SEQIDNO:1；SEQIDNO:3；以及SEQIDNO:5。7.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子被并入到病毒颗粒中。8.一种质粒，其特征在于，所述质粒包含权利要求1所述的核酸分子。9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含可操作性地连接至调控元件的权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·B·韦纳，严健，N·奥本阿杰伊，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学托管会，
类型：
国别省市：