特异性循环非小细胞肺癌细胞标志物的应用制造技术

本发明专利技术公开了特异性循环非小细胞肺癌细胞标志物的应用。SP70的单克隆抗体在制备非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞检测试剂中的应用。一种检测非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞的流式细胞检测试剂盒，包含荧光标记的SP70的单克隆抗体、溶血剂及PBS。本发明专利技术通过大量实验研究发现，SP70可作为由非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞检测的一个敏感、特异的检测指标，检测非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞，可大大提高非小细胞肺癌诊断的敏感性和特异性，同时具有很好的疗效监测及预后作用，具有很高的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了特异性循环非小细胞肺癌细胞标志物的应用。SP70的单克隆抗体在制备非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞检测试剂中的应用。一种检测非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞的流式细胞检测试剂盒，包含荧光标记的SP70的单克隆抗体、溶血剂及PBS。本专利技术通过大量实验研究发现，SP70可作为由非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞检测的一个敏感、特异的检测指标，检测非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞，可大大提高非小细胞肺癌诊断的敏感性和特异性，同时具有很好的疗效监测及预后作用，具有很高的临床应用价值。【专利说明】特异性循环非小细胞肺癌细胞标志物的应用
本专利技术属于生物检测领域，涉及特异性循环非小细胞肺癌细胞标志物的应用。
技术介绍
肺癌是全世界范围内发病率和死亡率居首位的恶性肿瘤，对人类健康造成极大的威胁，并有逐渐增加的趋势。肺癌在我国的发病率和死亡率也居各种恶性肿瘤的首位，每年约有120万患者死于肺癌。近年来，随着城市空气污染的加重，特别是PM2.5含量持续维持高位，人口的持续增长，人口老龄化的加剧，再加上吸烟、职业暴露和人体自身免疫力下降等影响肿瘤发病和死亡的危险因素的增加，肺癌的发病率和死亡率明显上升。根据不同的临床表现及对放化疗的灵敏度，可将肺癌分为两大类，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC),非小细胞肺癌约占肺癌的80%?85%。很多患者确诊时已为晚期，错过最佳手术时期，此外无法耐受放疗或化疗及化疗后耐药等原因，导致肺癌5年生存率在近三十年左右的时间内仍然停留在15%这样一个非常低的水平。I期经手术根治性治疗的NSCLC中，仍有超过30%患者在5年内复发，且复发部位多为全身性转移，提示现有临床分期的早期就可能已有肺癌微转移(Micrometastasis)的发生，而常规的影像学、组织学或细胞学等方法难以发现。肿瘤细胞进入血液循环是肿瘤发生远处转移的关键步骤之一。因此，对肺癌患者特异性循环肺癌细胞(specific circulating lung cancer cell, SCLCC)检测的研究已受到越来越多的重视。1869年，Ashworth发现血液中的一种血细胞同尸检发现的肿瘤细胞相似，首次提出循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)的概念。目前CTCs定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的一类肿瘤细胞，其极少见于正常人。经过免疫逃避未被清除的CTCs不仅在一定条件下可以发展为转移灶，而且可以通过迁移、粘附、相互聚集形成循环微癌栓(circulating tumor microemboli, CTM)。最新研究表明这种微小癌栓还可以附着于血管内皮，导致血栓形成，引起静脉血栓栓塞(venousthromboembolism, VTE)。目前的肿瘤转移理论认为,肿瘤细胞需要先从原发灶脱离并进入血液或淋巴循环，才能在远处形成转移灶。因此，理论上CTCs与肿瘤的血行转移有直接关系，深入研究CTCs有助于对肿瘤转移机制的进一步了解，为抗肿瘤转移的治疗提供新的依据。CTCs检测作为发现肿瘤早期转移的新方法，无创且比传统方法如临床表现、影像学表现及血清标志物更可靠。CTCs的检测有助于早期转移肿瘤患者的诊断、监测术后患者肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗策略，而且对于晚期无法取得肿瘤组织的患者起源于实体瘤的CTCs为其靶向治疗的分子学检测开启了一扇大门。目前CTCs已被用来研究多种肿瘤，如，乳腺癌、前列腺癌、直肠结肠癌、肺癌等的微转移并指导临床治疗。但是，对于CTCs的检测和分析却并不容易，因为CTCs并没有显著的特异性同其它血细胞明确区分，而且不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物；此外，CTCs在外周血中数量稀少，精确分离很困难，限制了 CTCs的应用。随着人们对肿瘤转移机制研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTCs逐渐被人们所重视，目前广大肿瘤研究人员特别关注的是如何找到CTCs的特异性标志物并提高检测手段的敏感性和特异性。随着CTCs检测技术得到不断改进，已取得了一些突破性的进展，部分检测方法在稳定性、敏感性及特异性等方面均已较理想，临床应用研究也已取得明显进展。目前用于循环肿瘤细胞检测的方法流程都是基于对肿瘤细胞的富集和分析两步法。一般而言，CTC检测通常包括富集技术和分析技术。富集技术主要通过一些物理化学原理将这些细胞特异性地富集起来，提高CTCs检测的敏感性。分析技术大致可以分为细胞计数和基于核酸的技术，主要依靠肿瘤细胞上存在的一些肿瘤特异性或器官特异性标记以及肿瘤细胞本身的形态学特征来发现CTCs。实际操作中常需要选择两个部分的不同方法并加以有效结合，最终寻找出敏感性和特异性均较高的方法。由于手工方法的步骤繁多，导致重复性差，灵敏度也很低，通常需要计数IO5?7才能够发现I个肿瘤细胞。现有的技术需要的检测人员水平和技术平台水平均高，因此性价比低；同时，现有的技术无法实现真正意义上的特异性循环肺癌细胞的检测。所以，现有的CTCs检测技术不能够用于特异性循环肺癌细胞的检测。本实验室前期以人肺腺癌细胞株SPC-Al为抗原，免疫BALB/c小鼠，常规细胞融合，间接细胞ELISA法筛选阳性细胞克隆，得到一株高效价并稳定分泌IgGl抗人非小细胞肺癌单克隆抗体的细胞株NJ001 ；ffestern blot显示单抗NJ001特异性结合的抗原相对分子质量(Mr)为70000左右，因此该蛋白被命名为SP70 ;免疫荧光法证实单抗NJ001能特异地识别肺癌细胞系，其识别抗原在非小细胞肺癌细胞的胞浆中和胞膜上均有表达，胞浆中表达量更丰富；细胞间接ELISA检测结果表明单抗NJ001对肺腺癌及鳞癌细胞株有特异性反应，而与其他常见肿瘤细胞株及正常细胞无反应或低反应性。免疫组化结果表明单抗NJ001与非小细胞肺癌组织有强阳性反应，而与小细胞肺癌、其他组织类型的肿瘤及正常肺组织呈弱阳性或阴性反应，因此证明了 SP70在非小细胞肺癌诊断中的特异性，且大于85%的非小细胞肺癌组织有此特异性SP70抗原的表达。通过双抗体夹心ELISA方法，已证实SP70在NSCLC患者的血清和胸腔积液中均有较高的阳性检出率，可作为NSCLC诊断以及鉴别诊断的标志物，具有重要的临床价值。然而，SP70在非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞中是否表达尚未见报道。目前，临床常用于检测非小细胞肺癌血清样本的主要肿瘤标志物，有癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片断(CYFRA21-1)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。CEA是一类具有人类胚胎抗原特异性决定簇的酸性糖蛋白，存在于细胞膜上，在胚胎发育阶段及肿瘤组织中表达，为非特异的肿瘤标志物。CYFRA21-1是一种酸性多肽，主要存在于肺癌、食管部等上皮起源肿瘤细胞的胞质中，正常时CK19以寡聚物形式存在，血清中含量极低。NSE是一种酸性蛋白酶，仅存在于神经元和神经内分泌细胞中。它们是在肿瘤细胞的溶解或坏死后脱落释放进入血液引起异常增高；在肺癌引起的恶性胸水中也本文档来自技高网...

【技术保护点】
SP70作为非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞标志物在制备非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞检测试剂中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘世扬，王芳，凌芸，徐婷，黄珮珺，
申请(专利权)人：潘世扬，
类型：发明
国别省市：