单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法技术

本发明专利技术应用双功能纳米金磁微粒，提供一种集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析技术，快速检测单核增生李斯特氏菌的检测方法。将免疫磁分离和免疫层析有机整合，免去了将单核增生李斯特氏菌从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将胶体金喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率。该检测方法基本思路是探索纳米金磁微粒和抗体有效结合的方式，优化其富集单核增生李斯特氏菌的条件，以免疫层析技术为载体，以双抗夹心为检测原理，进行快速定量检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术应用双功能纳米金磁微粒，提供一种集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析技术，快速检测单核增生李斯特氏菌的检测方法。将免疫磁分离和免疫层析有机整合，免去了将单核增生李斯特氏菌从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率；免去了将胶体金喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率。该检测方法基本思路是探索纳米金磁微粒和抗体有效结合的方式，优化其富集单核增生李斯特氏菌的条件，以免疫层析技术为载体，以双抗夹心为检测原理，进行快速定量检测。【专利说明】
本专利技术涉及微生物检测领域，具体采用双功能纳米金磁微粒集成免疫磁珠捕获技 术和免疫层析快速检测单核增生李斯特氏菌。技术背景单核细胞增生李斯特氏菌简称单增李斯特氏菌{Listeria monocytogenes, LM), 是李斯特菌属中最重要的人类食源性病原菌。肉、蛋、海产品、乳制品、蔬菜等食品均是LM 的主要污染源，人被LM感染后死亡率可达30%，在新生婴幼儿和免疫力低下的人群中死亡 率则高达70%。该菌在4°C冰箱保存的食物中仍能生长繁殖，使其成为冷藏食品中主要的病 原菌之一。按照我国国标法规定的检测方法，完成LM初筛过程需72、6h。如此长的检测周 期给企业、国家相关部门对日常产品质量监测及LM中毒事件进行快速反馈带来了一定困 难。免疫学检测是实现LM快速筛查的有效手段之一。比较经典的流程包括前期增菌、 免疫磁珠高效富集及胶体金免疫层析试纸条或ELISA检测等步骤。其中提高免疫磁珠富集 效率对缩短LM检出时间具有较大的贡献。免疫磁分离是基于抗原、抗体免疫学反应，利用 超顺磁粒子在磁场存在时能迅速磁化并聚集、磁场消失后可重新分散于溶液的特性的一种 磁分离方法。一些研究把免疫磁捕获和实时荧光PCR技术结合起来，检测食品中的单核增 生李斯特菌。PCR方法和生物传感器方法都具有较高的检测灵敏度，一般可将检测时间减少 至24-48小时(依据不同检测项目而言)，但是该方法要求具有较高素质的操作人员、较好的 检测仪器以及检测条件，因此较难在基层以及企业大面积推广使用，同时检测时间仍很难 满足企业对出厂前产品质量安全进行快速反应的实际需求，且该方法无法分辨死/活致病 菌以及DNA片段的同源性，易造成假阳性偏高的结果；而在检测很多食品基质时，又会因为 一些物质的存在而抑制了 DNA聚合酶的活性，从而造成假阴性。免疫学尤其是免疫层析方 法，不需复杂仪器设备，检测时间快(一般15 min即可获得结果)，易操作，但目前该类方法 总体检测灵敏度偏低(需要细菌浓度需达到105—6 CFU/mL)，因此针对食品样品检测，往往需 要较长的增菌时间。目前单核增生李斯特菌免疫学方法，采用胶体金免疫层析技术检测，从 增菌到检测需要至少24小时才能实现25 g样品中单菌的检测。由于微生物的生长具有其特定的生理周期，通过优化培养条件缩短时间效果不明 显；因此多采用免疫磁珠分离技术富集。依赖于特异性抗体的免疫磁珠分离技术可有效地 提高待测微生物的检测灵敏度，已逐渐成为食源性致病菌特异性分离和浓缩的最有效手段 之一，并广泛应用于单核增生李斯特菌等食源性致病菌的富集，大大缩短了食源性致病菌 整体检测时间。以膜为固相载体的胶体金免疫层析法是20世纪80年代在单克隆抗体技术、胶体 金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型检测方法。由于其快速、便捷、不需特 殊设备、结果判断直观、可以现场进行检测的特点，近年来越来越受到人们的重视，其技术 发展迅速，在的检测领域得到了广泛应用。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，标记物的颜色很淡几乎用肉眼难以判断结果，虽然目前市场上有针对胶体金等标记的免疫层析试纸条判读的仪器，但是这种仪器仅能对在固相载体表面的标记物颜色检测，而对固相载体内部的标记物很难检测到，因此检测的灵敏度受到很大限制。同时检测的生物样本中可能含有颜色物质会严重影响检测的结果和灵敏度。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种快速、灵敏、简便的单核增生李斯特氏菌定性、定量检测技术。本专利技术具体方案如下:，包括以下步骤:1)制备偶联单抗的金磁微粒；取抗单核增生李斯特氏菌单抗与纳米金磁微粒混合；在温度37°C时，放在转速为 10-15rpm的旋转仪上，偶联时间3(T60min,磁分离3、min,弃上清；用清洗缓冲液清洗3 遍之后，用ImL封闭剂与磁珠混合封闭Ih ；2)使用偶联单抗的金磁微粒捕获菌:培养单核增生李斯特氏菌，将菌液浓度调整为107CFU/mL、106 CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取I mL备用；取待测样品溶液I mL、各浓度菌液I mL，分别与步骤I)所得偶联单抗的金磁微粒10(Tl50ii g，温度37°C，转速1015rpm混合孵育3(T60min，；孵育后磁分离3-5min后， 弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中；3)制作免疫层析试纸条；将单核增生李斯特氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线T线和质控线C线，浓度均为 1.(T2.0mg/mL，喷量均为0.5-1.0 y L/cm，37°C真空干燥过夜，将样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸、滤纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4宽的条子，装卡；将制备好的试纸条置于锡箔袋中加干燥剂密封，置于干燥缸保存备用；4)利用双抗夹心法对样品进行测定； 将捕获到菌的金磁微粒稀释到浓度50-150 u g /mL，取100 u L滴加到试纸条加样孔中， IOmin后用免疫层析分析仪读取，记录T线吸光度、C线吸光度和T/C的值；5)定性分析:用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有单核增生李斯特氏菌，T线不显色则说明样品中没有单核增生李斯特氏菌或是含有单核增生李斯特氏菌的量低于104CFU/mL ； 6)定量分析:使用免疫层析分析仪测量T线、C线的吸光度，T线和C线的吸光度的比值记为T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线；参考所做的标准曲线图，确定普通样品中的单核增生李斯特氏菌数量。步骤I)纳米金磁微粒粒径为50nm ;步骤I)抗单核增生李斯特氏菌单抗的量 200-300 u g对应50nm的纳米金磁微粒的量为0.5-1.0mgo步骤3)所述免疫层析试纸条是在粘性底板上依次粘贴样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸、滤纸组成，没有结合垫。使用单核增生李斯特氏菌胶体金试纸条，同时使用免疫层析分析仪定量检测的方法，其特征在于:配制已知系列浓度的单核增生李斯特氏菌溶液，用免疫层析分析仪测出其对应的光密度的数值，根据这一系列数值与对应浓度建立标准曲线，然后将检测样品的试纸条放入免疫层析分析仪中，根据免疫层析分析仪输出的数值，查标准曲线图即可得出样本中单核增生李斯特氏菌的含量。本专利技术有以下优点:I)本专利技术采用的纳米金磁微粒，兼有磁性纳米粒子的超顺磁性以及胶体金表面高效偶联抗体的性能。由于纳米金磁微粒可以借助其表面的静电作用、疏水作用及Au-SH作用等 非共价键作用，物理性的吸附抗体等蛋白物质，偶联率高，偶联效果稳定、而且在偶联过程 中能够保证抗体的活性不受影响。2)本专利技术将免疫磁分离和免疫层析有机整合，免去了将单核增生李斯特氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）制备偶联单抗的金磁微粒；取抗单核增生李斯特氏菌单抗与纳米金磁微粒混合；在温度37℃时，放在转速为10?15rpm的旋转仪上，偶联时间30~60min，磁分离3~5min，弃上清；用清洗缓冲液清洗3遍之后，用1mL封闭剂与磁珠混合封闭1h；2）使用偶联单抗的金磁微粒捕获菌：培养单核增生李斯特氏菌，将菌液浓度调整为107CFU/mL、106?CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取1?mL备用；取待测样品溶液1?mL、各浓度菌液1?mL，分别与步骤1）所得偶联单抗的金磁微粒100~150μg，温度37℃，转速10?15rpm混合孵育30~60min，；孵育后磁分离3~5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中；3）制作免疫层析试纸条；将单核增生李斯特氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线T线和质控线C线，浓度均为1.0~2.0mg/mL，喷量均为0.5~1.0μL/cm，37℃真空干燥过夜，将样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸、滤纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的条子，装卡；将制备好的试纸条置于锡箔袋中加干燥剂密封，置于干燥缸保存备用；4）利用双抗夹心法对样品进行测定；将捕获到菌的金磁微粒稀释到浓度50?~150?μg?/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10min后用免疫层析分析仪读取，记录T线吸光度、C线吸光度和T/C的值；5）定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有单核增生李斯特氏菌，T线不显色则说明样品中没有单核增生李斯特氏菌或是含有单核增生李斯特氏菌的量低于最低检测下限104CFU/mL；6）定量分析：使用免疫层析分析仪测量T线、C线的吸光度，T线和C线的吸光度的比值记为T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线；参考所做的标准曲线图，确定普通样品中的单核增生李斯特氏菌数量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赖卫华，山珊，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：